הבסיס הביוכימי והגנטי של תגובת גנוטיפים של תירס סופר מתוק לקוטל העשבים פורמסולפורון

Transcript

1 הבסיס הביוכימי והגנטי של תגובת גנוטיפים של תירס סופר מתוק לקוטל העשבים פורמסולפורון עבודת גמר מוגשת לפקולטה לחקלאות, מזון וסביבה, ע"ש רוברט ה. סמית האוניברסיטה העברית בירושלים לשם קבלת תואר "מוסמך במדעי החקלאות" ע"י עמית פאפוריש כסלו תשע"ה רחובות דצמבר 4102

2

3 עבודה זו נעשתה בהדרכת: פרופסור ברוך רובין, המכון למדעי הצמח והגנטיקה בחקלאות הפקולטה לחקלאות, מזון וסביבה, ע"ש רוברט ה. סמית, רחובות. האוניברסיטה העברית בירושלים

4

5 תודות לפרופ' ברוך רובין על ההנחיה המסורה והאמון הרב שנתת בי לכל אורך הדרך. תודה שפתחת לי את הדלת לעולם המחקר, ולא פחות חשוב מכך לבית והמשפחה שהיא המעבדה לעשבים. לד"ר צפריר ויינברג על הסיוע והעצות המועילות, הן במהלך תיכנון וביצוע הניסויים והן בכתיבת העבודה. לצוות המעבדה לעשבים: ד"ר קובי גולדווסר, ד"ר משה סיבוני, מאור מצרפי, זיו קליינמן, גל דבורקין, יפעת יאיר, הדס מרימצ' קי, אלעד חיות, גלעד שלו, הדר קוז'יקרו, תם קליפר, אייל פריידמן, עובדיה כוכבי, שי גורליק ונטע-לי מויאל. לכל אחד ואחת מכם יש חלק בעבודה זו, אם בעצות מועילות ואם בסיוע בביצוע ניסויים בפועל. מעבר לכך, הייתם לי בית חם בשנים האחרונות ועל כך לכולכם תודה. לירון גדרי על שיתוף הפעולה והקצאת שטח בשדות הניסויים לביצוע הכלאות. ליואל רובין על שיתוף הפעולה בביצוע ניסוי השדה. לד"ר און רבינוביץ' על טרמפים רבים מספור, אל הפקולטה וממנה, שבמהלכם למדתי רבות על מחקר, חקלאות ומה שבינהם. לחברות: גליל זרעים בע"מ, עדן זרעים בע"מ, לידור כימיקלים ו- CropScience,Bayer על אספקת חומר צמחי וחומרי הדברה לצורך המחקר. לנותני המלגות השונות: הפקולטה לחקלאות, מזון וסביבה; חברת אדמה פתרונות חקלאיים על מלגה ע"ש אליהו תאומים ז"ל; משרד החקלאות על מלגת 'האורגניזם השלם'; מועצת הכותנה על מלגה ע"ש סם המבורג ז"ל. למשפחתי היקרה על התמיכה והעידוד לכל אורך הדרך, ובייחוד לשותפתי לחיים רותי ובני האהוב אורי על סבלנות אין קץ ועל האהבה הגדולה.

6

7 רשימת קיצורים ג' גח"פ ד' ח"א ל' מ' מ"ל ס"א סמ"ק ע"ר ק"ג ק"ע גרם גרם חומר פעיל דונם חומצת אמינו ליטר מטר מיליליטר סולפוניל- אוריאה סנטימטר מעוקב עשבים רעים קילוגרם קוטל עשבים µg µl µm ACC S ai ALS CYT P450 ED 50 EPSPS GST HPPD I 50 mm nm PD ppb sh2 SSR V Wt Microgram Microliter Micromolar Acetyl Co-A Carboxylase Active Ingredient Acetolactate Synthase Cytochrome P450 mono-oxyganase המינון הגורם ל- 05% פחיתה במדד הנבדק 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase Glutathione S-transferase 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase המינון הגורם ל 05% עיכוב בפעילות האנזים Milimolar Nanomolar Phytoene desaturase Parts per billion Shrunken Endosperm Small sequence repeat Volume Weight

8

9 תוכן העניינים תקציר מבוא סקירת ספרות גידול תירס עשבים רעים בגידול תירס קוטלי עשבים מעכבי...ALS פורמסולפורון הדברה בררנית של עשבים רעים CYT P בצמחים סייפנרים חומרים ושיטות חומר צמחי תנאי גידול וטיפול בקוטלי עשבים תגובת קווי התירס לקוטלי עשבים תגובה לקוטלי עשבים לאחר הצצה תגובה לקוטלי עשבים קדם הצצה תגובה ליישום מפוצל של פורמסולפורון וסייפנרים ניסוי שדה מבחן ביולוגי להערכת רגישות תירס לאקיפ מיצוי גס של האנזים ALS ותגובתו לפורמסולפורון ריצוף מקטעים בגן... ALS הפקת...DNA ריצוף המקטעים עיכוב אנזימים ממשפחת... CYT P450 11

10 3.9 בחינת התורשה של רגישות לאקיפ בתירס הכלאות בחינת רגישות צאצאי ההכלאות סמנים גנטים לרגישות לאקיפ תוצאות ודיון תגובת קווי התירס לאקיפ מבחן ביולוגי להערכת רגישות תירס לאקיפ בחינת עמידות באתר המטרה... ALS תגובת האנזים in vitro ALS לפורמסולפורון רצף הגן ALS בשני מקטעים מועדים למוטציות המקנות עמידות תגובת קווי התירס לקוטלי עשבים מקבוצות שונות השפעת סייפנרים על תגובת קווי התירס לפורמסולפורון השפעת מעכב פעילות CYT P450 על תגובת קווי התירס לקוטלי עשבים תורשת רגישות לאקיפ סמנים גנטים לרגישות לאקיפ דיון מסכם רשימת ספרות I-III... Abstract

11 תקציר פורמסולפורון הינו קוטל עשבים )ק"ע(, מקבוצת הסולפוניל-אוריאה, המשמש להדברה בררנית לאחר הצצה של עשבים רעים דגניים ורחבי עלים בתירס, ע"י עיכוב האנזים Acetolactate (ALS) Synthase הגורר עיכוב בביוסינתזה של חומצות אמינו מסועפות בצמח. בפורמולציה המשווקת בישראל )אקיפ( פורמסולפורון משולב עם הסייפנר הבררני איזוקסדיפן-אתיל, שתפקידו להגן על התירס מפני פגיעת ק"ע, ללא הפחתה ביעילות הדברת עשבים רעים )ע"ר(, ככל הנראה ע"י הגברה בררנית של נטרול קוטל העשבים בגידול. על אף שהוא מיועד לתירס, ומורשה לשימוש בהדברת ע"ר במכלואי תירס שונים בישראל, קיימות עדויות רבות המצביעות על שונות בתגובת תירס מתוק וסופר מתוק לפורמסולפורון. בעבודה זו נבחן מנגנון התגובה, ותורשת התגובה, לפורמסולפורון בגנוטיפים של תירס סופר מתוק. השערות המחקר הן: 1( בגנוטיפים של תירס סופר מתוק הרגישים לפורמסולפורון מנגנון פירוק ק"ע בצמח אינו פעיל עקב פגם ישיר, או לחילופין פגם בתגובה לסייפנר איזוקסדיפן-אתיל ו- 2 ( תורשת פנוטיפ התגובה היא מנדלית פשוטה- גן יחיד עם אלל דומיננטי לעמידות ורצסיבי לרגישות. כבסיס לעבודה שימשו ארבעה קווי תירס מטיפוס -sh2 שני קווי הורים הומוזיגוטים 'IBER001'( ו-' IBER002 '(, המכלוא של השניים )'ER00X'( ומכלוא נוסף מרקע גנטי שונה.)'PVS '( נמצאו הבדלים מובהקים בין הקווים בתגובתם לריסוס אקיפ לאחר הצצה: 'IBER001' ו-' PVS ' רגישים למינונים נמוכים של אקיפ, וערכי ED 50 שלהם הם 3.6 ו גרם חומר פעיל )גח"פ( להקטר בהתאמה, לעומת 'IBER002' ו-' ER00X ' שאינם נפגעים גם במינונים גבוהים עד פי 0 מהמינון המומלץ, וערכי ED 50 שלהם הם ו גח"פ להקטר בהתאמה. בתנאי שדה נמצא כי 'IBER001' לא שורד טיפול במינון המומלץ )40 גח"פ להקטר(, לעומת 'IBER002' ו- 'ER00X' ששרדו ללא פגיעה מהותית בהתפתחות. המכלוא 'PVS' אינו אחיד בתגובתו- מרבית הפרטים לא שרדו טיפול באקיפ בשדה לעומת כ- 25% מהפרטים ששרדו ללא פגיעה מהותית בהתפתחות. הבדלים בין הקווים בתגובה לאקיפ ניתנים לזיהוי במבחן ביולוגי, הבוחן התארכות הנצר של נבטי תירס לאחר טיפול קדם זריעה באקיפ, ומאפשר לאפיין את פנוטיפ התגובה בצורה פשוטה תוך חיסכון בזמן ומשאבים. בקווי 'IBER' והמכלוא שלהם, נמצאה התאמה בין פנוטיפ התגובה לאקיפ )רגיש/עמיד( ופנוטיפ התגובה לקוטל העשבים מעכב האנזים HPPD טמבוטריון + הסייפנר איזוקסדיפן-אתיל )לאודיס(, והתאמה לפנוטיפ התגובה למעכבי ALS רימסולפורון )טיטוס(, יודוסולפורון + הסייפנר מפנפיר )הוסאר( ושילוב של פורמסולפורון + יודוסולופורון + תיאנקרבזון-מתיל + הסייפנר ציפרוסולפמיד )מייסטר פאוור(. 1

12 האפשרות של הבדלים בין הקווים ברגישות אתר המטרה של פורמסולפורון נשללה: לא נמצאו הבדלים בעיכוב )in vitro( ALS של הגנוטיפים השונים ע"י פורמסולפורון. בנוסף, לא נמצאו מוטציות ברצף החלבון, בשני אתרים אשר מוטציה בהם מקנה עמידות. תגובת ארבעת הקווים לריסוס לאחר הצצה של פורמסולפורון בלבד, ללא הסייפנר איזוקסדיפן, אינה שונה מהתגובה לאקיפ- הקווים הרגישים לא שרדו והעמידים לא נפגעו מטיפול פורמסולפורון במינון 40 ו- 95 ג' להקטר. נוכחות סייפנרים שונים בפורמולציות המסחריות, וכן שילוב הסייפנרים דיכלורמיד ובנוקסקור עם פורמסולפורון בפורמולציה שהוכנה במעבדה, לא הגן על הצמחים הרגישים לפורמסולפורון 'IBER001' ו-' PVS ' מפגיעת ק"ע. על מנת לבחון מעורבות ציטוכרום P450 בפנוטיפ התגובה של תירס לאקיפ, רוססו קווי התירס השונים במלתיון אורגנופוספאט מעכב פעילות P450- לפני הטיפול בקוטלי עשבים. מלתיון כשלעצמו לא פגע בתירס, אך טיפול מוקדם בו הביא להגברה מובהקת בפיטוטוקסיות של התכשירים אקיפ )במינון 95 ג' ח"פ להקטר(, טיטוס, הוסאר וכן של פורמסולפורון )40 ג' להקטר( בקווים 'IBER002' ו-' ER00X '. הוספה של הסייפנר איזוקסדיפן לטיפול מלתיון + פורמסולפורון שיככה את ההגברה של הפיטוטוקסיות של פורמסולפורון, עובדה המעידה שאיזוקסדיפן משפיע באופן חיובי על פעילות P450, ובכך מגביר נטרול פורמסולפורון בתירס. בקווים 'IBER001' ו- 'PVS' מנגנון הפירוק כפי הנראה פגום ולכן הם בעלי רגישות מוגברת לפורמסולפורון. על מנת לבחון את ההשערה כי תורשת התגובה לפורמסולפורון היא מנדלית פשוטה, נבחן הפנוטיפ בצאצאי הכלאות שונות: צאצאי הכלאות רציפרוקליות של קווי ההורים 'IBER002' ו-' IBER001 ' אינם שונים בתגובתם לאקיפ, עובדה השוללת תורשה אימהית של הפנוטיפ. צאצאים מדור F2 של המכלוא,'ER00X' וצאצאי הכלאות מחזירות שלו עם קו ההורה הרגיש, מתפצלים בתגובתם לאקיפ ביחס שאינו שונה במובהק מ- 1:3 ו- 1:1, עמידים: רגישים, בהתאמה. לעומת זאת בהכלאה מחזירה עם ההורה העמיד כל הצאצאים עמידים. צאצאים מדור F2 של המכלוא 'PVS' וצאצאי הכלאת מבחן עם הקו הרגיש 'IBER001' הינם בעלי פנוטיפ רגיש, בעוד צאצאי הכלאת מבחן עם הקו העמיד 'IBER002' בעלי פנוטיפ עמיד. ממצאים אלו מאששים את ההיפותזה כי תורשת התגובה לאקיפ הינה מנדלית פשוטה- גן יחיד בעל אלל דומיננטי לעמידות )R( ואלל רצסיבי לרגישות )s(. הגן -Nsf1 בעל אלל דומיננטי )Nsf1( ואלל רצסיבי -)nsf1( אופיין בעבר כקשור בפנוטיפ התגובה של תירס לקוטלי עשבים המפורקים ע"י P450 )ביניהם פורמסולפורון(. שני סמנים גנטים פולימורפים- bnlg1382 ו- dupssr1 - שמופו בעבר ונמצאו בתאחיזה לגן זה נבחנו בעבודה זו. מופע הסמנים הנ"ל פולימורפי בין קווי ההורים 'IBER001' ו-' IBER002 ', ונמצא בקורלציה לפנוטיפ התגובה לאקיפ במכלואים ובצאצאים מדור F2. ממצאים אלו, נוסף על ממצאים לגבי מעורבות P450 בתגובה לאקיפ, מעלים את הסברה כי הגן Nsf1 מבקר את תגובת גנוטיפים של תירס סופר מתוק שנחקרו בעבודה זו. הגנוטיפ המשוער של כל אחד מהקווים הוא: nsf1nsf1 Nsf1Nsf1,)'IBER001'(.)'PVS'( nsf1nsf1 ו- )'ER00X'( Nsf1nsf1,)'IBER002'( 2

13 0. מבוא פורמסולפורון הינו קוטל עשבים )ק"ע(, מקבוצת הסולפוניל-אוריאה )ס"א(, המשמש להדברה בררנית לאחר הצצה של עשבים רעים )ע"ר( דגניים ורחבי עלים בתירס, ע"י עיכוב האנזים( ALS ) Acetolactate Synthase הגורר עיכוב בביוסינתזה של חומצות אמינו )ח"א( מסועפות בצמח. בפורמולציה המשווקת בישראל )אקיפ( פורמסולפורון משולב עם הסייפנר הבררני איזוקסדיפן-אתיל. תפקידו של הסייפנר הוא להגן על התירס מפני פגיעת ק"ע, ללא הפחתה ביעילות הדברת ע"ר. מרבית הסייפנרים המוכרים בספרות עושים זאת ע"י הגברת ביטוי ופעילות של אנזימים וחלבונים המעורבים בתהליכי נטרול של ק"ע בצמח כגון: Cytochrome P450 Glucose transferase ו- Glutathione S-transferase (GST) אסטראזות,, (CYT P450).)Rubin and Casida 1985 Bunting et al. 2005; Hatzios and Burgos 2004( )GT( על אף שהוא מיועד לתירס, ומורשה לשימוש בהדברת ע"ר במכלואי תירס שונים בישראל, קיימות עדויות רבות המצביעות על שונות בתגובת מכלואי תירס מתוק וסופר מתוק למינון המומלץ של פורמסולפורון: מעמידות מוחלטת ללא סימני פגיעה ניכרים, דרך רגישות קלה הכוללת סימני פגיעה חולפים ועד לרגישות מוגברת שעשויה להביא לתמותת הצמח ואובדן מוחלט של היבול )לנדה וחוב' ; )Diebold et al. 2003; Pataky and Meyer הסברה המקובלת היא כי הבדלים ביעילות תהליכי דטוקסיפיקציה עומדים בבסיס השונות בתגובת מכלואי תירס לק"ע מעכבי.ALS מספר מחקרים הראו כי הרגישות של תירס לפורמסולפרון אינה ספציפית וקווים רגישים נפגעים גם מק"ע נוספים, הן מקבוצת הס"א והן מקבוצות כימיות ומנגנוני פעולה שונים, המשותף לק"ע אלו הוא שכולם עוברים נטרול מהיר בצמחי תירס עמידים בתיווך CYT P450 )Hinz et al. 1997; Moreland et al. 1993; Nordby et al. 2008; Pataky and Meyer 2008( רגישות צולבת כזו של מכלואי תירס, למספר ק"ע, עשויה לפגוע קשות ביכולת ההתמודדות עם ע"ר בשדה. על אף האמור, לא ניתן לשלול על הסף את האפשרות שהרגישות לפורמסולפורון נובעת משונות ברגישות האנזים.ALS הבדלים ברגישות אתר המטרה מתועדים בספרות, דוגמת עדויות לקיומם של שני איזוזימים של,ALS בעלי רגישות שונה לק"ע )1985,)Rubin and Casida וכן קיומם של זני תירס מסחריים עמידים למעכבי ALS עקב מוטציה אקראית באתר המטרה המקנה עמידות.)Newhouse et al. 1991; Abayo et al. 1998( פערי המידע לגבי המנגנונים המבקרים רגישות של מכלואי תירס שונים לפורמסולפורון, מקשים על זיהוי מוקדם של מכלואים אלו. בתווית הפורמולציה המסחרית מופיע מספר מצומצם של מכלואים בהם בטיחות החומר נבדקה והוכחה, ושימוש בתכשיר בזנים נוספים מחייב בחינה מסודרת של העמידות בשדה, דבר שגוזל זמן רב, כסף ושטח- במקרים רבים בדיקות כנ"ל אינן מבוצעות והמגדל משתמש בחומר, תוך נטילת סיכון רב. הבנה כוללת של המנגנונים העומדים בבסיס רגישות של תירס לק"ע, בנוסף על פיתוח שיטות פשוטות ומהירות לזיהוי קווים רגישים, עשויים לסייע בטיפוח 3

14 מכלואים עמידים, בזיהוי מוקדם של הרגישים, במניעה של החדרת מכלואים רגישים לשוק ובפיתוח תכשירי הדברה בטוחים לגידול. כבסיס לעבודה זו שימשו ארבעה קווים של תירס סופר מתוק, מטיפוס shrunken endosperm ו-' IBER002 '- 'IBER001' שזוהו בתצפית אקראית בשדה כבעלי תגובה ייחודית לאקיפ:,(sh2) קווי הורים הומוזיגוטים האחד מפגין רגישות מוגברת ואילו השני עמיד לאקיפ, הניתן לאחר הצצה במינון המומלץ; -'ER00X' המכלוא של שני הקווים שהראה עמידות לאקיפ בשדה ו-'- PVS '- מכלוא רגיש לאקיפ מרקע גנטי שונה מהקווים הנ"ל. השערות המחקר: 1. בגנוטיפים של תירס סופר מתוק הרגישים לפורמסולפורון מנגנון פירוק ק"ע בצמח אינו פעיל: א( עקב פגמים ישירים בתהליכי דטוקסיפיקציה בצמח, כגון מוטציה ב- P450 CYT ספציפי, הגורמים לרגישות צולבת לק"ע נוספים. ב( עקב פגם בתגובה לסייפנר איזוקסדיפן-אתיל, המונע הגברת פירוק ק"ע בצמח. 2. תורשת התכונה מנדלית- פנוטיפ התגובה מבוקר ע"י גן יחיד עם אלל דומיננטי לעמידות ואלל רצסיבי לרגישות. מטרות המחקר: מטרת העל היא זיהוי המנגנון הביוכימי המבקר את התגובה הסלקטיבית של גנוטיפים שונים של תירס סופר מתוק לפורמסולפורון. מטרות משנה: 1. בחינת תגובת קווי תירס רגישים לפורמסולפורון לק"ע נוספים, מקבוצות כימיות ומנגנונים שונים המשמשים להדברת ע"ר בתירס. 2. פיתוח מבחן ביולוגי לזיהוי מהיר של מכלואי תירס רגישים לפורמסולפורון, בשלב הנבט. 3. לבחון סמנים מולקולריים ספציפיים אשר עשויים לסייע בסלקציה לעמידות/רגישות לפורמסולפורון בתכניות טיפוח תירס. 4. בחינת התורשה של תכונת הרגישות. 4

15 4. סקירת ספרות 4.0 גידול תירס תירס mays( )Zea הינו צמח ממשפחת הדגניים )Gramineae( אשר מוצאו ביבשת אמריקה. התירס הוא הגידול השני בהיקפו בעולם )אחרי חיטה(, כאשר שטחי המזרע הגלובליים כוללים כ- 114 מיליון הקטר )2013.)FAOSTAT ניתן לחלק את הגידול לארבעה שימושים עיקריים: מזון לאדם, מזון לחיות משק, חומר גלם לתעשיית המזון וחומר גלם לתעשיית הדלקים הביולוגיים. בישראל מגדלים ארבעה טיפוסי תירס שונים: תירס מתוק, תירס סופר מתוק, פופקורן ותירס מספוא, בגידול שלחין. תנאי הגידול האופטימליים הם באקלים חם, לכן בישראל נהוג לזרוע תירס מאמצע פברואר ועד תחילת יוני )ברקוביץ 2555(. טיפוסי תירס סופר מתוק מסוג,sh2 הינם גנוטיפים של תירס בעלי מסלול צבירה שונה של פחמימות בגרגר מטיפוסי תירס בעלי אנדוספרם רגיל. טיפוסי sh2 מאופיינים ברמות עמילן נמוכות וברמות סוכרוז גבוהות בגרגר הבשל, זאת עקב מוטציה הגורמת לירידה ניכרת בביטוי הגן המקודד לחלבון,ADP-glucose pyrophosphorylase אנזים מפתח בביוסינתזת עמילן בתירס ( and Tsai.)Nelson עשבים רעים בגידול תירס בהגדרה, 'עשב רע'- הוא כל צמח הגדל במקום ו/או זמן בו הוא אינו רצוי וגורם לנזק כלכלי. ע"ר מתחרים עם הגידול החקלאי על משאבים כגון: מים, מינרלים ואור, ועשויים אף לגרום נזקים עקב שחרור מולקולות אללופטיות- פיטוטוקסיות לצמחים השכנים. בהדברת עשבים נהוג להתייחס לתקופה הקריטית, בה התחרות בין העשב לגידול גורמת לנזק כלכלי (2004,(Zimdahl כאשר Hall וחובריו )1992( הדגימו כי בתירס, על אף שונות רבה בין זנים ותנאי סביבה, ניתן לתחום את התקופה הקריטית משליפת העלה ה- 0 )V0( ועד לשליפה מלאה של העלה ה- 14 )V14( בקירוב. נזקי ע"ר בתירס עשויים להתבטא בפחיתה ניכרת ביבול, אשר עשויה להגיע ל- 95%, כתלות במין העשב וצפיפותו. בנוסף, בתירס המגודל לתעשייה ונקטף מכנית שיבוש בעשבים עשוי לגרום הפרעה מכנית לאסיף ולפחת עקב הבשלה לא אחידה. כמו כן, נוכחות עשבים מסוימים במהלך האסיף עשויה לגרום לפגיעה באיכות היבול )ברקוביץ 2555; 2004.)Zimdahl הדברת עשבים בגידול תירס מבוססת על שילוב בין הדברה מכנית )בעיקר קלטורים ועישוב ידני( והדברה כימית באמצעות ריסוס ק"ע לפני ואחרי הצצה. בארצות בהן מותר לגדל צמחים מהונדסים גנטית נפוץ גידול תירס מהונדס הנושא גן לעמידות לק"ע )לרוב לק"ע גלייפוסט מעכב האנזים,)[EPSPS] 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase ולכן הדברת העשבים הכימית במקרה זה מבוססת בעיקר על גלייפוסט. גידול תירס טרנסגני כנ"ל נמצא במגמת עליה עולמית ונכון לשנת 2513 עמד על 32% משטחי מזרע התירס בעולם )2014.)Clive עם זאת, במרבית מדינות אירופה וכן במדינת ישראל, גידול צמחים טרנסגניים אסור עפ"י חוק ולכן הדברה כימית 0

16 בתירס מבוססת על מספר חומרים מצומצם, בהם קיימת בררנות טבעית, או שימוש בק"ע לא בררניים בריסוס מכוון/מוגן. בישראל מספר ק"ע המורשים לשימוש בתירס )השירותים להגנת הצומח 2514( הפועלים באחד מארבעה מנגנוני פעולה עיקריים: מעכבי ביוסינתזה של חומצות אמינו מסועפות )מעכבי )ALS מקבוצת הסולפוניל אוריאה- רימסולפורון )טיטוס( ופורמסולפורון )אקיפ(. מעכב פוטסינתיזה )מעכבי -)PSII אטרזין )משווק בשמות מסחריים שונים(, מעכבי ביוסינתזה של קרוטנואידים )מעכבי PD ו- -)HPPD דיפלופניקן )קוורץ(, איזוקספלוטול )באלאנס( וטמבוטריון* )לאודיס* בתהליכי רישוי בישראל(, ומעכב ביוסינתזת חומצות שומן ארוכות שרשרת- S -מטולכלור )דואל-גולד( ( Shaner 2014(. החומרים הנ"ל משמשים להדברה בררנית של ע"ר בתירס וניתנים הן קדם )אטרזין, דיפלופניקן, איזוקספלוטול, S -מטולכלור( והן לאחר הצצה )אטרזין, רימסולפורון, פורמסולפורון וטמבוטריון(. בנוסף נפוץ שימוש בגלייפוסט )משווק בשמות מסחריים שונים( להדברת עשבים בהכנת שטחים לפני זריעה ובריסוס מכוון במהלך העונה. 4.3 קוטלי עשבים מעכבי ALS האנזים Acetolactate Synthase/AcetoHydroxy Acid Synthase -AHAS/ALS הינו אנזים מפתח בביוסינתזה של ח"א מסועפות בצמח )ואלין, לאוצין ואיזולאוצין(. ALS מקטלז את השלב הראשון במסלול ביוסינתזת ח"א הנ"ל- דחיסה של שתי מולקולות pyruvate לקבלת acetolactate או דחיסת מולקולת pyruvate עם מולקולת α-ketobutyrate לקבלת acetohydroxy butyrate.)umbarger 1978( ק"ע מעכבי ALS משתייכים ל- 0 קבוצות כימיות שונות: סולפוניל-אוריאה, אימידזולינונים, טריאזולפירימידינים, פירימידינטיובנזואטים וסולפונילאמינו-קרבונילטריאזולינונים. מולקולות אלו נעות בעיקר בשיפה, אל רקמות מריסטמתיות שמהוות מבלע חזק, נקשרות אל האנזים ALS ומעכבות את פעילותו. הסברה הרווחת היא כי תמותת הצמח מתרחשת עקב מחסור בח"א מסועפות אשר גורם לעיכוב בסינתזת חלבונים בצמח, אך נוסף על כך ישנן עדויות להשפעות שליליות נוספות כגון הצטברות מולקולות רעילות )דוגמת )α-ketobutyrate ועיכוב הובלת מוטמעים בצמח 2007( al..)zhou et מעכבי ALS הינם ק"ע פוטנטיים במיוחד, המינונים לשימוש בשדה הינם בסדר גודל של עשרות גרמים ואף גרמים בודדים של חומר פעיל להקטר )2007 al.,)zhou et בעוד שבמבחני עיכוב האנזים in vitro דרוש ריכוז בסדר גודל של עשרות nm לקבלת פחיתה של 05% בפעילות האנזים של צמחים רגישים 1998(.)Rubin and Casida 1985; Wright and Penner עמידות לק"ע מעכבי ALS עשויה לנבוע ממוטציה אקראית נקודתית בגן, הגורמת להחלפה של ח"א בודדת ברצף החלבון. בשנות ה- 95 דווח לראשונה על אוכלוסייה של העשב קוכיית המכבד scoparia( )Kochia עמידה לק"ע כלורסולפורון כתוצאה ממוטציה נקודתית שגרמה להחלפה של 6

17 ח"א בעמדה 197 באנזים המטרה מפרולין לטראונין )1995 al..)guttieri et כיום ידוע על שמונה אתרים בחלבון ALS אשר החלפת ח"א באחד מהם, עקב מוטציה אקראית, גורמת לעמידות לק"ע. ב- 140 מינים של ע"ר נמצאה עמידות למעכבי.)Heap )2014 ALS בתירס טופחו זנים מסחריים לעמידות ל- ALS, באמצעות מוטגנזה בתרביות רקמה, הנושאים מוטציה באתר 074 באנזים המטרה בעקבותיה הוחלפה ח"א טריפטופן בלאוצין. זנים אלו מאפשרים הדברה בררנית של ע"ר בתירס 1998;( Abayo et al. 1998; Krausz and Kapusta al )Newhouse et עם זאת, עמידות תלוית אתר מטרה למעכבי ALS אינה נפוצה בזני תירס מסחריים. בתירס, כמו גם גידולים דגניים נוספים דוגמת חיטה, מתרחש נטרול מהיר של ק"ע ממנגנונים שונים, ביניהם חלק ממעכבי,ALS אשר מונע הגעתם אל אתר המטרה והיא שמקנה להם עמידות מפני נזקי ק"ע הנ"ל )2006.)Siminszky 4.2 פורמסולפורון פורמסולפורון הינו ק"ע מעכב ALS מקבוצת הס"א, המיועד להדברת ע"ר לאחר הצצה בתירס, שנכנס לשימוש מסחרי בישראל ובעולם במהלך העשור האחרון. המינון המומלץ לשימוש הינו ג' להקטר- מינונים שנמצאו יעילים בהדברה בררנית של ע"ר רחבי עלים ודגניים בגידול תירס, ביניהם כף-אווז לבנה album(,)chenopodium זיפן ירוק viridis(,)setaria אמברוסיה לענתית Abutilon ( אבוטילון,)Amaranthus retroflexus( ירבוז מופשל,)Ambrosia artemisiifolia( )theophrasti וחלבלוב קעור heterophylla( )Euphorbia ללא פגיעות משמעותיות בגידול )לנדה וחוב' 2559; 2007 al..)nurse et סימני הפגיעה האופייניים לחומר בצמחים רגישים הם עצירה מוחלטת של הצימוח, בטווח זמן של שעות מהיישום. לאחר שבוע עד שבועיים מהיישום- הופעה של כתמים כלורוטים באזורים מריסטימתים ועלים צעירים, לאחריה התפשטות של כלורוזה ונקרוזה כללית בצמח )2014.)Shaner בעולם משווק פורמסולפורון בפורמולציות מסחריות שונות הכוללות סייפנר, לעיתים בתערובת עם ק"ע נוספים. בישראל משווק התכשיר תחת השם המסחרי אקיפ, בפורמולציה הכוללת את הסייפנר איזוקסדיפן-אתיל ביחס משקלי של 1:1 )השירותים להגנת הצומח 2514(. איזוקסדיפן-אתיל מקטין את נזקי ק"ע לתירס )2004a,)Bunting et al. יישומו ככל הנראה מגביר ביטוי גנים הקשורים בנטרול ק"ע בצמח ביניהם גנים ל- P450s CYT ו- GSTs )Behringer et al. )2011 ובכך מגביר את העמידות הטבעית ובטיחות השימוש בפורמסולפורון בגידול תירס. אף על פי כן, קיימים זני תירס רגישים לפורמסולפורון, בטווח המינונים המומלץ )2008 al..)nordby et 4.5 הדברה בררנית של עשבים רעים הדברה בררנית )סלקטיבית( של ע"ר בחקלאות משמעה הדברת עשבים ללא פגיעה בגידול התרבותי. כאשר מדובר בהדברת עשבים כימית, באמצעות ק"ע, הדברה בררנית מתאפשרת כאשר 7

18 קיים הבדל מהותי בביולוגיה של הגידול לעומת הע"ר, אשר עשוי להתבטא בהבדלים אנטומיים, פיזיולוגיים ו/או ביוכימיים המאפשרים לגידול להתחמק מנזקי החומר. ניתן לחלק את הבררנות לשלושה מנגנונים עיקריים: א( התחמקות: ק"ע אינו נקלט, או שנקלט אך אינו נע בצמח. אחת הדוגמאות היא התחמקות עקב הישארות )retention( נמוכה של ק"ע על העלה המונעת קליטה של החומר- דוגמת צמחי חרצית השדות segetum(,)chrysanthemum בעלי שכבת שעווה אפיקוטיקולרית על העלה המקטינה הישארות )גרינשפון 2551(. דוגמה נוספת למנגנון התחמקות היא בררנות שכבתית בטיפולי קדם הצצה. לדוגמה כותנה hirsutum( )Gossypium המטופלת בק"ע דיניטרואנילינים. בתנאי גידול נורמליים השורש השיפודי של הכותנה נובט ומתארך במהירות, וכך חוצה את שכבת הקרקע בה מצוי החומר וקולט מים משכבות בהן החומר אינו מצוי 1967) al..(anderson et ב( עמידות תלוית אתר מטרה: פעילות אנזים המטרה של ק"ע אינה מעוכבת, או מעוכבת במידה פחותה ע"י החומר, עקב אפיניות נמוכה בין השניים. עמידות מסוג זה עשויה להיות טבעית, נרכשת- עקב מוטציה אקראית באתר המטרה- או מהונדסת גנטית. דוגמה לעמידות טבעית תלוית אתר מטרה הינה עמידות לק"ע מעכבי האנזים.ACCs לחלבון זה שני איזוזימים בעולם הצומח: האחד מקורו איאוקריוטי והינו רגיש לק"ע, ואילו השני ממקור פרוקריוטי ואינו מעוכב ע"י ק"ע. במרבית משפחות הצמחים ניתן למצוא את שני האיזוזימים ואילו במשפחת הדגניים קיים האיזוזים הרגיש בלבד ( al. Konishi et 1996( עובדה המשמשת להדברה של עשבים דגניים בגידולים שאינם רגישים. עמידות נרכשת, עקב מוטציה באתר המטרה, הינה תופעה נפוצה ונחקרת במדע העשבים הרעים. שכיחות אוכלוסיות ע"ר עמידים בחקלאות נובעת משילוב בין תדירות המוטציה בגן המטרה ולחץ הסלקציה המופעל עליה. לחץ הסלקציה הינו פועל יוצא של ממשק ההדברה הנקוט בשדה- כזה המבוסס על ק"ע מאותו מנגנון פעולה לעומת ממשק המשלב ק"ע ממספר מנגנוני פעולה שונים והדברה קולטורלית. על מנת שתתאפשר עמידות תלוית אתר מטרה, השינוי באנזים צריך להיות כזה שלא יפגע בכשירות )fitness( של הצמח. לדוגמה, ישנן מוטציות באנזים ALS הפוגעות באתר הקשירה של ק"ע ומקנות עמידות, אך אינן פוגעות משמעותית בתפקוד הנורמלי של האנזים, לכן אין פגיעה מהותית בכשירות הצמחים העמידים )2010.)Powels and Yu לעומת זאת מוטציות ב- PSII, באתר הקשירה של פלסטוקווינון,)PQb( המקנות עמידות לק"ע, מקטינות את האפיניות של PQ לאתר הקשירה, פוגעות בפוטוסינתיזה ולכן פוגעות בכשירות הצמח )1991.(Rubin, עמידות מהונדסת גנטית לק"ע מנצלת את הטכנולוגיה של החדרת גנים מאורגניזם אחד לאחר על מנת להחדיר גנים שמקנים לגידול החקלאי עמידות שאינה קיימת באופן טבעי. המקרה הנפוץ הינו החדרת גן ממקור חיידקי המקודד לאנזים,EPSPS אשר אינו מעוכב 1

19 Glycine ( )Brassica spp.( ע"י ק"ע גלייפוסט, לגידולים כגון תירס, כותנה, קנולה וסויה.(Dill 2005) )max ג( עמידות מטבולית: עמידות מטבולית נובעת מיכולתו של הצמח לפרק מולקולות זרות,)xenobiotics( טבעיות או סינתטיות, דוגמת ק"ע. מטבוליזם של ק"ע ע"י הצמח עשוי להוביל לנטרולם- בהנחה שהפעילות ההרביצידית של תוצרי הביניים פחותה או נעדרת. תהליך הנטרול מחולק לשלושה שלבים: שלב 1- המרה, ע"י אנזימים כגון CYT P450 ואסטראזות, במהלכה המולקולה מחומצנת, מחוזרת או עוברת הידרוליזה. שלב 2- קוניוגציה, למולקולות כגון גלוקוז וגלוטטיון מחוזר )GSH( ע"י. GST ושלב 3- מידור בחלולית,)vacuole( בדופן התא ו/או אתרים נוספים בתא )1997.)Hatzios עמידות מטבולית לק"ע תלויה בספציפיות האינטראקציה עם האנזימים השונים המעורבים בנטרול, וכן בקצב התהליך. עמידות מסוג זה עשויה להיות תכונה טבעית המאפיינת את המין אך עשויה לנבוע גם מלחץ סלקציה המופעל לאורך זמן על אוכלוסיית צמחים, כפי שנמצא לדוגמה בזון אשון rigidum(.)christopher et al. )1992 )Lolium בניגוד לעמידות תלוית אתר מטרה, עמידות מטבולית עשויה להתבטא בעמידות צולבת לק"ע ממנגנוני פעולה שונים- להם אתרי מטרה שונים בצמח )2008 al..)nordby et CYT P בצמחים )P450 Cytochrome P450 mono-oxygnase )CYT הינה משפחה ענפה של אנזימים המעורבים בעשרות ראקציות שונות בצמח, ביניהן תהליכי המרה של ק"ע כגון חמצון וחיזור, כשלב ראשון בתהליך תלת שלבי שעשוי להביא לנטרולם )1997 CYT P450.)Hatzios נמצא מעורב במטבוליזם של מספר רב של ק"ע, במגוון מיני צמחים, ביניהם: מעכבי ALS מקבוצת ס"א פורמסולפורון, ניקוסולפורון, רימסולפורון, כלורסולפורון ואחרים- בתירס, חיטה spp.(,)tritucum סויה, סורגום spp.( )Sorghum ועוד; מעכבי -PSII בנטזון, דיאורון ולינורון- בתירס, חמנית הפקעות tuberosus(,)helianthus חיטה וסויה; קלומזון )מעכב ביוסיתזה של קרוטנואידים( ומטולכלור )מעכב ביוסינתזת חומצות שומן ארוכות שרשרת( במיני תירס; D-2,4 )אוקסין סינתטי( בטוליפ ועוד ק"ע רבים אחרים )2006.)Siminszky מטבוליזם של ק"ע ע"י CYT P450 מקנה לצמח עמידות רק במקרה שלתוצר הראקציה רעילות פחותה, או שהיא מהווה שלב ראשון בשרשרת תגובות שמובילות לנטרול ק"ע. פעילות אנזימי CYT P450 עשויה להיות ספציפית לרקמה וכן תלויה בסובסטרט ספציפי ( Hatzios 1997( לכן נטרול של ק"ע מסוים ע"י אנזים כנ"ל אינו מבטיח נטרול של ק"ע אחרים. מאידך, תופעה של עמידות צולבת לק"ע שונים, כתוצאה מפעילות P450 ספציפי, מתועדת היטב בספרות.)Nordby et al. 2008; Williams and Pataky 2010( 9

20 נטרול ק"ע המתווך ע"י CYT P450 הינו הבסיס העיקרי לפעילות בררנית של מעכבי,ALS מקבוצת ס"א, בגידולי חיטה ותירס. ק"ע מקבוצה זו מפורקים במהירות בגידול התרבותי, לעומת פירוק איטי אם בכלל במרבית הע"ר, וכך מדבירים את העשב ללא פגיעה בגידול ( Tardif Corbett and 2006(. אף שפירוק מהיר של ק"ע נפוץ במכלואי תירס ישנם מכלואים המפגינים רגישות מוגברת למעכבי,ALS כמו גם לק"ע ממנגנונים נוספים, כגון: בנטזון )מעכב )Pataky et al. )2006 )PSII טמבוטריון 2008( )Williams and Pataky ומזוטריון 2008( al. )Nordby et )שניהם מעכבי.)HPPD הגנים המבקרים רגישות זו מופו ללוקוס בזרוע הקצרה של כרומוזום 0 בתירס אשר אופיין בו גן ל- CYT P450. האלל הרצסיבי בגן זה nsf1/ben1 מכיל ככל הנראה מוטציית מחדר שגורמת לאובדן פעילותו ולכן גורמת לרגישות לק"ע )2008 al..)nordby et אחת הדרכים להוכחת מעורבות CYT P450 בפירוק ק"ע במיני צמחים ספציפיים היא תגובתם לכימיקלים שונים המגבירים או מעכבים את פעילות האנזים )2006.)Siminszky לזרחנים אורגנים, כגון מלתיון, המשמשים כקוטלי חרקים בחקלאות, פעילות אנטגוניסטית ל- P450 -CYT צמחים עמידים להרבציד הופכים לרגישים בעקבות חשיפה מוקדמת למלתיון- עובדה בה משתמשים תדיר להוכחה עקיפה למעורבותם של אנזימים אלו בנטרול ק"ע ( al. Christopher et 1994(. לדוגמה, מיני עוקצר spp.( )Brachipodium עמידים לק"ע מעכבי ACCs אך אינם שורדים טיפול משולב של מלתיון וק"ע )2014 al..)matzrafi et מאידך סייפנרים, מולקולות סינתטיות המספקות הגנה לצמחים מסויימים מפני ק"ע, פועלים לעיתים קרובות באמצעות הגברת פעילות.)Hatzios and Burgos 2004( בצמח המגבירה פירוק ק"ע P סייפנרים המושג סייפנרים של ק"ע מתייחס לכימיקלים סינתטיים, שאינם רעילים בפני עצמם לצמחים, ומגנים באופן בררני על גידולים חקלאיים, אך לא על עשבים, מפגעי ק"ע. בררנות של סייפנרים נובעת מיישום סלקטיבי, כגון שימוש כעיטוי זרעים, או כתוצאה מאינטראקציות ספציפיות בין הסייפנר לגידול. סייפנרים אומנם מגינים על הגידול מנזקי ק"ע אך אין באפשרותם להפוך נזקים שכבר התרחשו, עקב כך יש חשיבות מכרעת לתזמון יישום הסייפנר וק"ע בזמן ובמרחב.)Hatzios and Hoagland 1919( כל הסייפנרים שנמצאים בשימוש מסחרי מגבירים את נטרול ק"ע בגידולים דגניים בלבד ובכך מגנים עליהם מנזקי ק"ע. ישנן עדויות רבות לכך שסייפנרים מגבירים באופן ישיר פעילות וביטוי של חלבונים ואנזימים המעורבים בשלבים השונים של מטבוליזם של ק"ע בצמח: סייפנרים שונים הגבירו תהליכי הידרוקסילציה ודה-מתילציה המקוטלזים ע"י,CYT P450 של ק"ע מעכבי ALS מקבוצות כימיות שונות, ביניהן ס"א- אף שלא ברור מה המנגנון המולקולרי המבקר תגובה זו. 15

21 בצמחי תירס הסייפנרים בנוקסקור ודיכלורמיד הגבירו את רמות הסובסטרט GSH )גלוטטיון( ואת רמות ציסטאין- אחת משלוש ח"א ברצף גלוטטיון; הוכח כי בתירס מספר איזוזימים ל- GST, חלקם קונסטיטוטיבים וחלקם אינדוקטיבים, אשר בעקבות טיפול בסייפנרים שונים עולה ביטויים; עוד בתירס, נמצא כי הגנה חלקית מק"ע כלורימורון-אתיל (מעכב )ALS ע"י הסייפנר BAS התקבלה בעקבות הגברת קוניוגציה לגלוקוז. נוסף על כך, ישנה סברה כי הסייפנרים, בשילוב ק"ע, גורמים לעקה אביוטית בצמח אשר גורמת לעליה בביטוי אנזימים המעורבים בדטוקסיפיקציה בצמח.)Hatzios and Burgos 2004( הסייפנר איזוקסדיפן-אתיל משולב בתערובות עם ק"ע שונים, ביניהם טמבוטריון ופורמסולפורון, בפורמולציות שונות המיועדות להדברה בררנית של ע"ר בתירס. אופן פעולותו של איזוקסדיפן ברמה הפיזיולוגית ומולקולרית אינה ברורה: יישומו על תירס יחד עם פורמסלפורון הגביר את פירוק ק"ע למטבוליט פולרי )2004b,)Bunting et al. אך מטבוליט זה לא אופיין ולא ברור איזה מסלול ביוכימי עומד בבסיס תגובה זו. לאחרונה נמצא כי יישום משולב של איזוקסדיפן והסייפנר מפנפיר בארבידופסיס ( Arabidopsis GSTs,P450s( גרם לעליה בביטוי גנים רבים המעורבים במטבוליזם של ק"ע )thaliana טרנספורטרים שונים ועוד( )2011 al..)behringer et אף שסייפנרים אלו לא מקנים הגנה לארבידופסיס, וצמחים רחבי עלים אחרים, מידע זה עשוי לסייע בהבנת מנגנון הפעולה שלהם- הגברת ביטוי גנים המעורבים בנטרול כאשר הגנה על הצמח מתקבלת רק במקרה של אינטראקציה ספציפית בין האנזימים וק"ע. על אף המחסור במידע על מנגנון הפעולה של איזוקסידיפן, תרומתו בהגנה על תירס מנזקי ק"ע מבוססת היטב );2004b Bunting et al.,2004a.) Williams and Pataky

22

23 ד/ 3. חומרים ושיטות מטיפוס 1(, )איור שימשו ארבעה קווים של תירס סופר מתוק זו 3.0 חומר צמחי כבסיס לעבודה אקראית בשדה כבעלי תגובה ייחודית שזוהו בתצפית (sh2),shrunken endosperm לפורמסולפורון. שלושה מהקווים התקבלו מד"ר צפריר ויינברג, והינם חלק מתכנית טיפוח של חברת גליל זרעים בע"מ. קווים אלו כוללים שני קווי הורים, הומוזיגוטים, 'IBER001' ו-' IBER002 '- הראשון השניים בין ואת המכלוא בשדה- הפגין רגישות והשני לא נפגע מטיפול אקיפ במינון המומלץ,'ER00X' שגם הוא לא נפגע מטיפול אקיפ במינון המומלץ. קו תירס נוסף שנבחן בעבודה זו הינו המכלוא 'PVS ',)Pop Vriend Seeds, Andijk, NL( שהתקבל מחברת עדן זרעים בע"מ לאחר שבמבחן זנים הפגין רגישות מוגברת לאקיפ, כאשר חלק קטן מהפרטים התחמק מפגיעה )איור 2(. מכלוא זה נמצא בתהליכי מסחור בישראל.?? IBER001 IBER002 PVS ER00X איור 0. קווי התירס שנבחנו במחקר. ( ) קו הורה הומוזיגוט זכרי, ( ) קו הורה הומוזיגוט נקבי ו-) תוצר הכלאה של קווי ההורים. ) מכלוא הטרוזיגוטי- 3.4 תנאי הגידול וטיפול בקוטלי עשבים הניסויים נערכו בעונות אביב/קיץ 2513/14. גרגרי התירס נזרעו בעציצי פלסטיק 7X6X6 ס"מ )גרגר אחד לעציץ( מלאים במצע גידול. העציצים הושמו תחת המטרה, בבית הרשת בפקולטה לחקלאות ברחובות, שם הונבטו הגרגרים והצמחים גודלו למשך 2-3 שבועות, עד לפריסה מלאה של 2-4 עלים. בשלב זה, רוססו הצמחים בחומר הרצוי. הריסוס התבצע באמצעות מרסס שולחני מצויד בפומית מניפה )8001E(, בנפח תרסיס של 35 ל' '. לאחר הריסוס נותרו הצמחים בחדר מאוורר למשך כשעתיים ובסיומן הועברו בחזרה לבית הרשת להמשך גידול. שבועיים מריסוס נבחנו הצמחים להופעת סימני פגיעה אופייניים לפעולת החומר. 12

24 איור 4. )4104( חלקת מבחן זני תירס בעמק יזרעאל לאחר טיפול באקיפ. אקיפ ניתן במינון 40 גח"פ להקטר, לצורך הדברת עשבים. הזן PVS ', מכלוא סופר-מתוק )במרכז התמונה( נפגע מאוד מהטיפול בעוד שאר המכלואים לא מראים סימני פגיעה. 3.3 תגובת קווי התירס לקוטלי עשבים ניסויים אלו כללו בחינת תגובת ארבעת הקווים לק"ע מקבוצות ומנגנונים שונים, בטיפולי קדם ולאחר הצצה. חומרי ההדברה בהם בוצע שימוש בעבודה זו מפורטים בטבלה 1. כל המינונים המופיעים בעבודה זו מתייחסים לגרם חומר פעיל )גח"פ( להקטר תגובה לק"ע לאחר הצצה: הצמחים רוססו בחומר הרצוי בארבעה מינונים X 1/2X, 1/4X, ו- 2X, נוסף על ביקורת לא מרוססת, כאשר = X המינון המומלץ )טבלה 1( וכל ניסוי כולל 4-0 חזרות. שבועיים מריסוס נבחנו הצמחים להופעת סימני פגיעה אופייניים לפעולת החומר נקצרו ונשקלו )משקל טרי(. נתוני המשקל נורמלו לאחוז מביקורת. על מנת ליצור עקום תגובה מהימן לפורמסולפורון בוצע ניסוי זהה, שכלל מספר וטווח רחב של מינונים של ק"ע אקיפ, שנבחרו עפ"י תגובת הקווים בניסוי הקדמי. הנתונים הוזנו לתוכנת )SYStat Software Inc. California, USA( SigmaPlot 9.0 ולכל אחד מהקווים הותאם עקום Log logistic המתאים לניתוח תגובה לק"ע )1995 al. -)Seefeldt et עקום סיגמואידי בעל ארבעה X EC50 =מינון ) B =שיפוע; Y min (max min )/(1 ( / 50) B פרמטרים שמשוואתו: ) EC y y y x שגורם ל- 05% תגובה( בנוסף בוצע מבחן F לבחינת הבדלים בין העקומות השונות, - -ED50 המינון הגורם ל- 05% פחיתה במדד הנבדק. וחולץ ערך 13

25 טבלה * בתוספת 5.2% משטח ** ;DX בתוספת 5.0% משטח ;DX ***בתוספת 1% משטח שמן..0 2,4-D חומר פעיל Atrazine Atrazine Bentazon Diflufenican Foramsulfuron Iodosulfuron Isoxaflutole Rimsulfuron S-Metolachlor Tembotrione קוטלי העשבים בהם סייפנר Cyprosulfamide Isoxadifenethyl Mefenpyrdiethyl Isoxadifenethyl - - Benoxacor Foramsulfuron+ Iodosulfuron+ Thiencarbazonemethyl נעשה שימוש יחס ח"פ:סייפנר :1 15:10:1:31.5 3: :20.3 1: 2 בניסויים השונים. שם מסחרי אלבר סופר אטרנקס אטרנקס בזאגרן קוורץ אקיפ מייסטר פאוור הוסאר באלאנס טיטוס דואל S גולד לאודיס תוארית תרכיז מתחלב תרכיז רחיף תרכיז רחיף תרכיז נוזלי תרכיז רחיף תרחיף שמן תרחיף שמן גרגרים רחיפים גרגרים רחיפים גרגרים רחיפים תרכיז מתחלב תרחיף שמן מינון מומלץ )גח"פ להקטר( * ** ***91.5 חומר פעיל בתכשיר )ג' בליטר/ק"ג( מנגנון פעולה אוקסין סינטטי PSII PSII PSII PD ALS ALS ALS HPPD ALS VLFA HPPD מועד יישום לאחר הצצה לאחר הצצה קדם הצצה לאחר הצצה קדם הצצה לאחר הצצה לאחר הצצה לאחר הצצה קדם הצצה לאחר הצצה קדם הצצה לאחר הצצה יצרן SIPCAM אדמה אגן אדמה אגן BASF Bayer CropScience Bayer CropScience Bayer CropScience Bayer CropScience Bayer CropScience Dupont Syngenta Bayer CropScience חברה משווקת בישראל אדמה מכתשים אדמה אגן אדמה אגן אדמה מכתשים לידור כימיקלים לידור כימיקלים לא משווק בישראל מרחב אגרו מרחב אגרו מרחב אגרו כ.צ.ט לא משווק בישראל 14

26 ד/ ל/ תגובה לק"ע קדם הצצה: 0-15 גרגרי תירס נזרעו בעציצי פלסטיק, 9X9X9 או 7X6X6 ס"מ בהתאמה, מלאים בחול חום רחובות. העציצים רוססו מיד לאחר הזריעה בק"ע הרלוונטים )טבלה 1( בארבעה מינונים X 1/2X, 1/4X, ו- 2X, נוסף על ביקורת לא מרוססת, וכל ניסוי כלל 0 נבחנו להופעת סימני פגיעה הצמחים תועד אחוז ההצצה בכל עציץ, שבועיים מריסוס חזרות. אופייניים לפעולת החומר, נקצרו ונשקלו )משקל טרי(. תגובה ליישום מפוצל של פורמסולפורון וסייפנרים: הטיפולים כללו ריסוס פורמסולפורון, עם וללא הסייפנר איזוקסדיפן-אתיל, בשני מינונים )40 ו- 95 גח"פ להקטר(, בנוסף על 3 ביקורות, יחס בלבד וביקורת לא מרוססת. טיפול באיזוקסדיפן )במינון תואם(, באקיפ טיפול בהתאם ליחס בפורמולציה )wt/wt( 1:1 בטיפולים המשולבים היה איזוקסדיפן:פורמסולפורון המסחרית אקיפ. ניסוי דומה נערך עם הסייפנרים דיכלורמיד ובנוקסקור, מקבוצת Dichloroacetamide המשולבים בתכשירים ק"ע המיועדים לתירס )1989.)Hatzios בניסוי זה נבחנה יעילותם של סייפנרים אלו, לצורך כך רוססו הצמחים בהגנה על התירס מנזקי פורמסולפורון. לעומת איזוקסדיפן-אתיל, 1:1 עבור כל הסייפנרים( בארבעה בפורמסולפורון בלבד או בשילוב עם סייפנר )ביחס משקלי מינונים- X 1/2X, 1/4X, ו- 2X - נוסף על ביקורת לא מרוססת. פורמולציות נוזליות של דיכלורמיד ובנוקסקור התקבלו מחברת אדמה מכתשים בע"מ ונמהלו במים Bayer ( פורמסולפורון ואיזוקסדיפן טכני התקבלו מחברת באייר לקבלת המינון הרצוי. )2512( Ikeda et al והוכנו לריסוס עפ"י פרוטוקול המתואר ע"י )CropScience, Frankfurt, GR נמהלה לאחר מכן פורמסולפורון או איזוקסדיפן הומסו תחילה באצטון, עם שינויים והתאמות. התמיסה לריכוז הרצוי עם תמיסה מימית המכילה 25 ג' Tween 20, Sigma-Aldrich, '.)Rehovot, IL) sorbitan monolaurate ריכוז אצטון בתמיסה הסופית לא עלה על 5.3%. שבועיים מריסוס נבחנו הצמחים להופעת סימני פגיעה, נקצרו ונשקלו. נתוני המשקל )כאחוז מביקורת( נותחו באמצעות תכנת )SAS Institute Inc., USA( JMP 8.0 ע"י ניתוח שונות דו-גורמי לאחריו בוצע מבחן (0.05=α) Dunnett להשוואת ממוצעי כל אחד מהטיפולים לביקורת. 3.2 ניסוי שדה ניסוי לבחינת תגובת הקווים השונים לפורמסולפורון בתנאי השדה, נערך בחלקה מסחרית של גד"ש העמק בקיבוץ שריד, לצד מבחן זני תירס מתוק וסופר מתוק מסחריים, בעונת כל קו נזרע בשורה באורך 4 מ' ב- 0-1 חזרות, באקראיות גמורה, בעומד סופי של צמחים למ' שורה. שבועיים מזריעה, כאשר לצמחים 2-4 עלים פרוסים, רוססו הצמחים במינון של 40 ג' להקטר פורמסולפורון )פורמולציה מסחרית אקיפ( באמצעות מרסס גב מצויד במוט ריסוס באורך 2 מ', עליו 0 פומיות מניפה )11002 )T-Jet בנפח תרסיס של 20 ל' '. 2 מ' הנותרים שימשו כביקורת לא 10

27 מרוססת. 11 יום מריסוס נבחנו הצמחים להופעת סימני פגיעה אופייניים לפעולת החומר. בכל אחת מהחזרות תועד אחוז השורדים למ', במרכז השטח המרוסס, והושווה לאחוז השורדים בביקורת. 3.5 מבחן ביולוגי להערכת רגישות תירס לאקיפ התארכות השורש והנצר של קווי התירס, בתגובה לטיפול בטווח רחב של מינוני פורמסולפורון )אקיפ(, נבחנה בשלב הנבט, במטרה לבחון אפשרות זיהוי קווים רגישים במבחן פשוט ומהיר. גרגרי התירס נזרעו עם העובר כלפי מטה בעומק של כ- 1.0 ס"מ, במבחנות בנפח 50 מ"ל שחוררו בתחתיתם מבעוד מועד- מלאים ב- 70 ג' קרקע חול חום רחובות, שיובשה )יבש אויר( וסוננה בנפה 2 מ"מ. כל אחת מהמבחנות הוגמעה לאחר הזריעה ב- 25 מ"ל מים או תמיסת ק"ע- נפח נוזל הממלא את כל חתך הקרקע ללא נגירה- לקבלת הריכוז הרצוי של ק"ע בקרקע. המבחנות הוצבו בחדר גידול בו נשמרה טמפרטורה של 20. C הניסוי כלל 3-0 חזרות לכל טיפול, בכל מבחנה נזרעו 3 זרעים. שבוע מזריעה נשלפו הנבטים מהקרקע, נשטפו קלות במים, אורך הנצר והשורש נמדד )מהקצה עד לבסיס( וחושב הממוצע עבור כל טיפול. נתוני אורך השורש או הנצר הוזנו לתכנת F כאחוז מביקורת, שורטט עקום תגובה מתאים )ע"ע סעיף 3.3.1), בוצע מבחן,SigmaPlot 9.0 לבחינת הבדלים בין העקומות בקווים השונים וחולצו נתוני.ED 50 (0.05=p) 3.2 מיצוי גס של האנזים ALS ותגובתו לפורמסולפון תגובת האנזים,in vitro,als לק"ע פורמסולפורון נקבעה ע"י מיצוי גס של האנזים מהרקמה הצמחית. מיצוי האנזים ובחינת התגובה לק"ע מבוסס על פרוטוקול מקובל )1984 )Ray עם שינויים והתאמות. האנזים מוצה מנבטי תירס אטיולנטים, אשר הונבטו במצע ורמיקוליט בחשכה בטמפרטורה של 20. C שבוע מזריעה נשלפו הנבטים מהמצע, טולטלו קלות להסרת שאריות ורמיקוליט, השורשים והנצרון הופרדו ונקצצו לפיסות בגודל של כחצי ס"מ באמצעות אזמל. המשך ההפקה בוצע בקירור או על קרח: 0 ג' של רקמה )שורש או נצר( נכתשו בחנקן נוזלי ו- 0% (PVPP) ]wt/v[ polyvinylpolypyrrolidone במכתש ועלי שקוררו מראש. אל הרקמה הכתושה הוסף בופר הפקה קר, ביחס של 1:0 )בופר:רקמה(. בופר ההפקה 100mM( פוטסיום פוספט thiamine [TPP] 0.5mM מגנזיום כלוריד, 0.5mM סודיום-פירובט, 10mM,]pH7.5[ [FAD] flavin adenine dinucleotide 10µM,pyrophosphate ו- 10% ]V/V[ גליצרול( הוכן בבוקר ההפקה ומיד לפני ההפקה הוסף.)DTT( dithiothreitol 0.2mM הרקמה נכתשה יחד עם בופר ההפקה, סוננה דרך 4 שכבות פד גזה, והועברה לסרכוז בצנטריפוגה ב -C 15,000g 4 למשך 35 דקות. התסנין הועבר למבחנה נקייה והובא ל- 05% רוויה עם אמוניום סולפט, תוך כדי טלטול עדין במשך 45 דקות. התמיסה הנ"ל סורכזה בצנטריפוגה ב- C 4555 rpm 4, למשך 35 דקות, והמשקע הורחף ב- 1 מ"ל בופר הפקה. ריכוז החלבון בדוגמה נמדד בשיטת ברדפורד )1976 )Bradford והתרחיף נמהל לריכוז חלבון של 1.5 מ"ג למ"ל. 16

28 לצורך מבחני עיכוב האנזים הוכנו תמיסות של ק"ע פורמסולפורון במינונים שונים, ע"י המסתו תחילה באצטון ולאחר סדרת מיהולים לריכוז רצוי של פורמסולפורון בתמיסת 50mM פוטסיום פוספט )7.0 -)ph ריכוז האצטון במבחנת הראקציה לא עלה על.)V/V( 0.005% פעילות ALS נמדדה בשיטה קולורימטרית, לאחר חיזור acetolactate שנוצר בראקציה ל- acetoine ומדידתו בראקצית צבע ספציפית (1945.(Westerfeld מבחנת הראקציה הכילה 300µg חלבון, 155µL של תמיסת ק"ע או מים מזוקקים, 500µL בופר ראקציה 05mM( פוטסיום פוספט,]pH7.0[ 100mM סודיום-פירובט, 10mM מגנזיום כלוריד, TPP 1mM ו- 10µM )FAD ו- 200µL בופר הפקה. מבחנות הראקציה הודגרו באמבט בטמפרטורה של 37 C למשך שעה, ולאחר מכן הופסקה הראקציה ע"י הוספת 100µL חומצה גופרתית 6N. הדוגמאות עברו הדגרה נוספת, ב- C 65 למשך 10 דקות, על מנת לחזר acetolactate שנוצר בראקציה ל- acetoin. לכל מבחנה הוספו 100µL של 150µL,NaOH 05% תמיסת קריאטין )5.0%( ו- 150µL )0%( α-naphthol ב- 2.5N,NaOH והמבחנות הודגרו ב- C 65 למשך 10 דקות לצורך פיתוח הצבע. הבליעה של הדוגמאות נקראה באורך גל של 530nm )מבחנת הבלנק הכילה את כלל המגיבים ללא החלבון( ועיכוב האנזים ALS ע"י פורמסולפורון נקבע עפ"י יחס הבליעה בדוגמאות המטופלות לעומת טיפול ביקורת ללא המעכב. הניסוי בוצע בשלוש חזרות )חזרות ביולוגיות( ובכל הפקה בוצעו שלוש חזרות טכניות. הנתונים הוזנו לתוכנת,SigmaPlot 9.0 Y Y a e bx הותאם עקום דעיכה בעל שלושה פרמטרים שמשוואתו:, 0 בוצע מבחן )0.05=p( F לבחינת הבדלים בין העקומות השונות וחולץ ערך.ED ריצוף מקטעים בגן ALS הפקת :DNA צמחי תירס מכל אחד מהקווים גודלו כפי שתואר לעיל )ע"ע סעיף 3.2), עד לשליפת 1-2 עלים. בשלב זה נלקחה פיסה )15-35 מ"ג( מהעלה הצעיר ביותר הנראה לעין, שאינו פרוש לחלוטין, מכל אחד מהפרטים בניסוי. הרקמה נשמרה בהקפאה בטמפ' של 25- C עד לשימוש. מהדגימות הנ"ל הופק DNA באמצעות Kit) 5-Prime, ArchivePure DNA Cell/Tissue (Hamburg, GR ע"פ הוראות היצרן, ונמהל פי 15 לפני השימוש ריצוף המקטעים: בגן המטרה ALS ישנם 1 אתרים פוטנציאלים למוטציות המקנות עמידות, כאשר לריצוף נבחרו שני אתרים, פרולין 197 וטריפטופן 074, אשר שכיחות מקרי המוטציה בהם היא הגבוהה ביותר )2014.)Heap לצורך כך תוכננו שני זוגות תחלים )טבלה 2( אשר כל אחד מהם מיועד להגביר מקטע הכולל אחד מהאתרים הנ"ל. להגברת מקטע הכולל את האתר 197 תוכננו תחלים על פי רצף הגן ALS בתירס )X63554 )GeneBank ולהגברת המקטע הכולל את האתר 074 נעשה שימוש בתחלים ידועים מזון spp.(.)yu et al. )2008 )Lolium המקטעים הוגברו בראקציית,PCR בנפח סופי של,25µL בריכוז סופי של 0.2µL לכל אחד מה- dntps ו- 17

29 94 ולאחריה לכל אחד מהתחלים. תכנית ה- PCR התחילה בארבע דקות דנטורציה ב- C 0.25µL 35,92 35 מחזורים, שכל אחד מהם כולל שניות של דנטורציה ב- C שניות התחברות )elongation( ב- C 06, ו- 35 שניות התארכות ב- C התוכנית הסתיימה ב- 7 )annealing( דקות של התארכות 72. סופית ב- C המקטעים שהתקבלו רוצפו במעבדה מתמחה, והרצפים Sathasivan et ( )A. thaliana( ALS של,Bioedit הושוו, בעזרת תוכנת הגן לרצף ארבידופסיס )al ומוקמו כך שיקבילו לעמדות הידועות בגן בצמח זה. על כן עמדות ח"א המצוינות בעבודה מתייחסות לעמדות המקבילות ברצף ALS של ארבידופסיס. טבלה 4. זוגות התחלים ששימשו להגברת שני מקטעים בגן ALS בראקציית.PCR רצף הבסיסים )3` 5`( שם התחל כיוון התחל גודל המקטע המוגבר )bp( 253 GCCACCAACCTAGTCTCTGC AGTTGTGCTTGGTGATGGAG Forward Reverse Zm197f Zm197r 532 TGGGCGGCTCAGTATTACAC TCCTGCCATCACCTTCCATG Forward Reverse ALS574 ALS עיכוב אנזימים ממשפחת CYT P450 לצורך בחינת מעורבות אנזימים ממשפחת CYT P450 בתגובת קווי התירס שנבחנו לפורמסולפורון, וק"ע נוספים, רוססו הצמחים במלתיון- קוטל חרקים אורגנו-פוספט הידוע כמעכב פעילות P450. צמחי התירס הונבטו וגודלו כפי שתואר )ע"ע סעיף 3.2(. לאחר פריסה מלאה של -2,05 עלים רוססו הצמחים ב להקטר מלתיון ג' )מלתיון אדמה מכתשים בע"מ(. שעה 4 מריסוס במלתיון רוססו הצמחים בק"ע במינון הרצוי. כל ניסוי כלל ארבעה טיפולים עיקריים- ביקורת + לא מרוססת, מלתיון בלבד, ק"ע בלבד ומלתיון ב- 4-0 ק"ע- חזרות. ניסוי דומה בוצע על מנת לבודד את השפעת מלתיון על התגובה לפורמסולפורון )ללא סייפנר(- מלתיון, איזוקסדיפן-אתיל ופורמסולפורון רוססו ב- 4-0 כל חומר חזרות, בנפרד וכן בכל השילובים האפשריים )מלתיון במינון 40[ להקטר[,) להקטר ג' ופורמסולפורון ואיזוקסדיפן במינון המומלץ ג' נוסף על ביקורת לא 1555.)3.2 מרוססת. כל החומרים רוססו באמצעות מרסס שולחני )ע"ע סעיף כשעתיים מתום הריסוס הועברו הצמחים לבית הרשת. שבועיים מריסוס נבחנו סימני הפגיעה, נקצרו הצמחים ונשקלו )משקל טרי(. נ תי וח שונות דו גורמי וכן השוואת הממוצעים לביקורת במבחן Dunnett בוצעו בתכנת.)α=0.05( JMP 11

30 3.9 בחינת התורשה של רגישות לאקיפ בתירס על מנת לבחון את אופן הורשת הרגישות לפורמסולפורון בתירס בוצעו הכלאות התפצלות הפנוטיפ )רגישות, עמידות או תגובת ביניים( בצאצאי ההכלאות. שונות, ונבחנה הכלאות: בוצעו ארבעה סוגי הכלאות/הפריות בין הקווים השונים: הפריות עצמיות של המכלואים 'ER00X'( ו-' PVS '(, הכלאות רציפרוקליות של קווי ההורים 'IBER001'( ו-' IBER002 '(, הכלאות מחזירות של המכלוא 'ER00X' ) ( עם כל אחד מקווי ההורים ) ( והכלאות מבחן של המכלוא 'PVS' ) ( עם כל אחד מקווי ההורים של 'ER00X' ) (. ההכלאות נערכו בארבעה אתרים: חלקת טיפוח של גליל זרעים בע"מ, בגד"ש נאות מרדכי )הכלאות רציפרוקליות(, בית רשת בחוות הניסיונות בפקולטה לחקלאות ברחובות )הפריה עצמית של,)'ER00X' בית רשת בפקולטה לחקלאות )הפריה עצמית של )'PVS' ובשטח פתוח בחוות הניסיונות בפקולטה לחקלאות )הכלאות מחזירות ומבחן(. מלבד הפריה עצמית של -'ER00X' שבוצעה בהפריה חופשית כיוון שבבית הרשת וסביבתו לא גודלו צמחי תירס נוספים- כל ההכלאות בוצעו תוך כיוס התפרחות, זכריות ונקביות, והאבקה ידנית על מנת להבטיח שלא תתקיים הפריה ממקור לא רצוי. בכל צמח כוסתה התפרחת הנקבית בקומה העליונה, לפני הגחת המשי, בשקית פוליאתילן. עם תחילת פיזור האבקה מהתפרחת הזכרית כוסתה התפרחת בשקית נייר חומה, אשר הודקה סביבה היטב על מנת לאסוף את האבקה. כאשר המשי התחיל להציץ מתפרחת מכוסה בשקית פוליאתילן, הוסרה השקית והוחלפה בשקית נייר חומה מלאה באבקה, עפ"י כיוון ההפריה הרצוי. שקית הנייר הודקה היטב סביב התפרחת הנקבית, על מנת שזו תישאר מכוסה בכל מהלך התפתחות הקלח. בסיום העונה, לאחר הבשלה פיזיולוגית של הגרגירים, נאספו מהצמחים קלחים מכוסים בשקית נייר שלמה בלבד )כלומר הופרו ידנית ולא נחשפו לאבקה זרה(. במידת הצורך יובשו הקלחים במשך מספר ימים בשקיות רשת בחדר מאוורר לפני הפקת הזרעים בחינת רגישות צאצאי ההכלאות: צאצאי ההכלאות השונות נבחנו לתגובתם לריסוס אקיפ במינון המומלץ. תנאי ההנבטה, גידול וריסוס זהים לתנאים שתוארו )ע"ע סעיף 3.2( בכל אחד מהמבחנים להלן פרט רגיש הוגדר ככזה שמשקלו נמוך ב- 05% ויותר ממשקל ממוצע הביקורת, ומראה סימני פגיעה אופייניים לפעולת פורמסולפורון כל אחד מהמכלואים, תוצרי ההכלאות הרציפרוקליות, נבחן ב- 12 חזרות בהשוואה לביקורת לא מרוססת. בדור F2 של המכלוא 'ER00X' נבחנה התפצלות הפנוטיפ ע"י ריסוס שלושה מדגמים בלתי תלויים של פרטים, הערכת סימני פגיעה והשוואת המשקל הטרי לצמחי ביקורת לא מרוססים. התפצלות F2 של 'PVS' בתגובה לפורמסולפורון נבחנה בשני מדגמים בלתי תלויים של פרטים בהשוואה להתפצלות המכלוא.'PVS' בצאצאי כל אחת מההכלאות המחזירות, או הכלאות המבחן, נבחנה התפצלות הפנוטיפ לאחר ריסוס של פרטים )בהכלאות עם )'IBER001' או ב- 45 פרטים )בהכלאות עם.)'IBER002' כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו בתכנת 19

31 2 :JMP 8.0 במקרה של אוכלוסיות מתפצלות, התוצאות נותחו במבחן (0.05=α) χ כאשר כהשערת אפס הוצבו יחסים הצפויים במקרה של תורשה מנדלית פשוטה לעמידות גורמי. ואלל רצסיבי המקנה רגישות במצב הומוזיגוטי. של גן יחיד עם בשאר המקרים בוצע אלל דומיננטי ניתוח שונות דו 3.01 סמנים גנטים לרגישות לפורמסולפורון שבעה סמנים גנטים, מסוג,)SSR( Small Sequence Repeat המאגפים את הלוקוס nfs1/ben1 בתירס, ונמצאו בעבר כפולימורפים בין קווים בעלי תגובה שונה לק"ע (,2008 al. Nordby et )Tseng 2012 הוגברו בראקצית PCR בקווים השונים. מופע הסמנים נבחן תחילה בקווי ההורים 'IBER001'( ו-' IBER002 '(. בהמשך, מופע סמנים שנמצאו פולימורפים בין שני הקווים נבחן בצמחים של המכלוא,'PVS' F2 שלו ו- F2 של המכלוא,'ER00X' לאחר ריסוס אקיפ בשלב 2-4 עלים וזיהוי הפנוטיפ )רגיש/עמיד(. אופן הפקת ה- DNA ותנאי PCR זהים לתנאים שתוארו )ע"ע סעיף 3.7( ונעשה תוך שימוש בתחלים ידועים )2008 al. )Schaffer et שפרטיהם מופיעים בטבלה 3. המקטעים שהוגברו הופרדו בג'ל אלקטרופורזה: הדוגמאות הורצו בג'ל, שהרכבו בופר TAE למשך שעתיים ב- 75V.,)Invitrogen, NY, USA( UltraPure המכיל Agarose 3% X0.5 טבלה 3. זוגות התחלים ששימשו להגברת מקטעי סמני SSR המאגפים את הלוקוס nfs1/ben1 בתירס. כיוון התחל רצף הבסיסים )3` 5`( עמדה על כרומוזום 5 שם הסמן Forward GCATACATGATACATGCCGTGACT Reverse TGCACACAGTAGGAAGACAGGAAG 91.1 umc1365 Forward TTTTCTTTCAAAAATATTCAGAAGC Reverse GCAGGATTTCATCGGTTGTT bnlg1382 Forward ACAAGAAGGAATCGAGAGCAAATG Reverse CTTCGGGATGGAGTCGTAGTTC umc1766 Forward GCACTGCCGGAGTGCCTTCT Reverse ATGCCGTGATCTGTGACATCTAACC bnlg143 Forward CAAAAGGTGCAACTGTAATTGCCT Reverse ATGAGGCGAAGCCAAGAAAAAGT umc1781 Forward TCAATCAAGCCTCTCGTAAGGAAC Reverse CTCTTGATCTCAACCGAAATCCTG umc2036 Forward TGTTCTCAACAACCACCG Reverse CGTTTAGCGATATCATTTTCC dupssr1 25

32

33 Shoot fresh weight (% of control) 2. תוצאות ודיון בעבודה זו נבחנו ארבעה קווים של תירס סופר מתוק שזוהו בתצפיות אקראיות בשדה כבעלי תגובה ייחודית לאקיפ: 'IBER001' ו-' IBER002 '- קווי הורים הומוזיגוטים האחד מפגין רגישות מוגברת ואילו השני עמיד לאקיפ, הניתן לאחר הצצה במינון המומלץ; -'ER00X' המכלוא של שני הקווים שהראה עמידות לאקיפ בשדה ו-' PVS '- מכלוא רגיש לאקיפ מרקע גנטי שונה מהקווים הנ"ל. 2.0 תגובת קווי התירס לאקיפ תגובת קווי התירס השונים, לטווח מינונים רחב של אקיפ, נבחנה בניסוי בעציצים, ושורטט עקום תגובה )איור 3(. בקו ההורה 'IBER001' ובמכלוא 'PVS' הופיעו סימני פגיעה קשים במינונים נמוכים מהמינון המומלץ של אקיפ )40 גח"פ להקטר(, והיה הבדל ניכר במשקל לעומת הביקורת. עקומי התגובה של שני הקווים אינם נבדלים זה מזה ברמת מובהקות 5.50 אך נבדלים ברמה 5.1 ושני הקווים הפגינו רגישות מוגברת לאקיפ המתבטאת בערכי ED 50,[p(F)=0.0718] ו ג' להקטר בהתאמה )טבלה 4(. נמוכים- 3.6 'Equip' (g ai ha -1 ) איור 3. עקום תגובה של תירס לטיפול אקיפ לאחר הצצה. נוף הצמחים נקצר ונשקל 14 יום מטיפול באקיפ. לעומתם בקו ההורה 'IBER002' ובמכלוא 'ER00X' לא הופיעו סימני פגיעה מהותיים וממוצע משקל הפרטים המטופלים לא היה נמוך מהביקורת גם במינונים גבוהים- עד פי 0 מהמינון המומלץ- רק במינונים גבוהים מאוד נראתה פגיעה משמעותית בצמחים ומשקל נמוך לעומת הביקורת. נמצא הבדל מובהק בין עקומי התגובה של 'IBER002' ו-' ER00X ' [p(f)=0.0228] אך ערכי,ED ו ג' להקטר בהתאמה, גבוהים משמעותית מהמינון המומלץ, עובדה המעידה על 21

34 Survivels (%) עמידות שני הקווים לאקיפ. יש לציין שעמידותו של הקו ההומוזיגוטי גבוהה מזו של הקו ההטרוזיגוטי. תגובת שני הקווים הרגישים נבדלת במובהק מתגובת קו ההורה העמיד 'IBER002'.]p(F) [ ER00X' והן מתגובת המכלוא ]p(f) [ טבלה 2. ערכי ED 50 שחולצו ממשוואת עקום תגובה לטיפול באקיפ לאחר הצצה ED 50 ( גח"פ להקטר( קו IBER001 PVS ER00X IBER002 הערכת התגובה בתנאי שדה, בוצעה בשטחי גד"ש העמק בקיבוץ שריד בקיץ ארבעת הקווים טופלו באקיפ במינון ובמועד המומלץ. 7 ימים מטיפול החלה להופיע בצמחי 'IBER001' ו- 'PVS' נקרוזה בקצוות העלים הצעירים ביותר, סימן פגיעה אופייני להרבציד, לעומת זאת בשני הקווים האחרים לא נראו סימני פגיעה. 11 יום מריסוס באקיפ תועד אחוז הפרטים השורדים )איור 4(. בקווים 'IBER002' ו-' ER00X ', שהפגינו עמידות לאקיפ בטווח המינונים המומלץ בניסוי עקום תגובה, כל הפרטים שרדו את הטיפול באקיפ ולא נראו סימני פגיעה או עיכוב בהתפתחות. בקו הרגיש 'IBER001' אף אחד מהצמחים לא שרד את הטיפול, ובמכלוא הרגיש 'PVS' 25% מהפרטים שרדו את הטיפול באקיפ. בצמחים השורדים במכלוא זה לא הופיעו סימני פגיעה והתפתחותם הייתה דומה לביקורת- כלומר 'PVS' אינו אחיד פנוטיפית בתגובה לאקיפ. 100 Control 'Equip' 45 g ai ha * * IBER002 IBER001 ER00X PVS Genotype איור 4. תגובת קווי תירס לאקיפ בשדה. קווי השגיאה מייצגים את שגיאת התקן.)n=8;*n=5( 22

35 יש התאמה בין התגובה בתנאי השדה לתגובה בניסויים בעציצים במעבדה: קו ההורה 'IBER001' והמכלוא 'PVS' רגישים מאוד לאקיפ ואינם שורדים טיפול במינון המומלץ- למעט הפרטים המתחמקים במכלוא. מאידך, 'IBER002' ו-' ER00X ' עמידים לטיפול במינון המומלץ בשדה ואף שורדים טיפול במינונים גבוהים בסדר גודל מהמינון המומלץ. הבדלים אלו בתגובה לאקיפ עשויים לנבוע מהבדלים ברגישות אתר המטרה או מהבדלים בנטרול ק"ע בצמח. קו ההורה 'IBER001' רגיש לאקיפ יותר מהמכלוא.'PVS' מקורם של קווים אלו ברקע גנטי שונה ולכן ישנה אפשרות כי הבדלים בתגובה לאקיפ נובעים ממנגנון תגובה שונה בין הקווים. בנוסף ל- 'PVS' און צימוח גדול יותר )עקב היותו מכלוא( עובדה שעשויה להשפיע על התמודדות עם פגעים כגון נזקי ק"ע. קו ההורה 'IBER002' עמיד יותר מהמכלוא.'ER00X' מכלוא זה הוא צאצא של ההורה הרגיש 'IBER001' וההורה העמיד,'IBER002' לכן ההבדל בעמידות לעומת 'IBER002' נובע ככל הנראה מכך ש-' ER00X ' הינו הטרוזיגוט בגן יחיד או מספר גנים הקשורים בתגובה לק"ע. 2.4 מבחן ביולוגי להערכת רגישות תירס לאקיפ על מנת לקצר את משך הזמן הדרוש להערכת רגישות מכלוא תירס לאקיפ, ולחסוך במשאבים, נבחנה אפשרות לזיהוי הפנוטיפ בשלב הנבט, לאחר הגמעת אקיפ בריכוזים שונים לקרקע לפני הזריעה. התארכות השורש והנצר היוו מדד לפגיעת החומר והנתונים שימשו להכנת עקום תגובה )איור 5( ולחילוץ ערכי ED 50 )טבלה 0(. פגיעות בשורש, שהתבטאו בעיכוב התארכות והסתעפויות שורש, נראו כבר בריכוזים נמוכים של ק"ע בקרקע ppb פורמסולפורון. התארכות השורשים בהשוואה לביקורת נפגעה במידה דומה בכל הקווים ואין הבדל מובהק בין עקומות התארכות השורש )איור 0 ב'(. לכן מדד זה אינו יכול לשמש להערכת רגישות לאקיפ. לעומת זאת תגובת הנצר לק"ע הייתה שונה בקווים השונים: בקווים העמידים לאקיפ 'ER00X'( ו- )'IBER002' התארכות הנצר לא נפגעה בצורה ניכרת, במינונים של עד 05 ppb פורמסולפורון, לעומת זאת בהורה הרגיש )'IBER001'( ובמכלוא הרגיש )'PVS'( אורך הנצר היה נמוך בכ- 45% בהשוואה לביקורת כבר במינונים של 05 ppb ו- ppb 25 פורמסולפורון בהתאמה )איור 0 א'(. תגובת כל אחד מהקווים,'IBER001' 'PVS' ו-' ER00X ' נבדלת באופן מובהק בהשוואה לתגובת ההורה העמיד 'IBER002'.]p(F) 0.01[ מכאן שהתארכות הנצר במבחן זה מאפשרת הפרדה בין קווים בעלי תגובה שונה לאקיפ. ערכי ED 50 שחושבו מעקומי תגובת הנצר )טבלה 0( גבוהים במידה ניכרת בקווים העמידים לעומת הקווים הרגישים לאקיפ במינון המומלץ, ועשויים לשמש מדד כמותי אמין, להערכת רגישות של תירס סופר מתוק לאקיפ בשלב הנבט. 23

36 תגובת השורשים לאקיפ במבחן זה שונה מהותית מתגובת הנצר. בכל הקווים השורשים נפגעו בריכוזים נמוכים של ק"ע, וערכי ED 50 בשורש נמוכים )טבלה 0(. בניסוי בו יושם אקיפ לאחר הצצה, ונבחנה השפעתו על השורשים והנצר, לא הופיעה תופעה זו בקווים העמידים, ולא נצפתה פגיעה הן בשורש והן בנצר, ואילו בקווים הרגישים נפגעו גם השורש וגם הנצר )מידע אינו מוצג(. טבלה 5. ערכי ED 50 שחולצו ממשוואת עקום תגובה לטיפול אקיפ קדם זריעה קו ED 50 )ppb( נצר שורש א PVS IBER ER00X ב IBER002 איור 5. עקום תגובה לטיפול אקיפ קדם הצצה. 7 אורך הנצר נמדדו )ב( והשורש )א( ימים מזריעה. המינון הינו ריכוז ק"ע בקרקע.)wt/wt( עיכוב מוגבר של התפתחות השורש, בעקבות טיפול אקיפ בצמחים העמידים, עשוי לנבוע מעיכוב תנועת מוטמעים מהנצר )2007 al..)zhou et אשר בשלב הנבט, לפני התבססות הצמח, אינו מאפשר התפתחות תקינה של השורש. אפשרות נוספת היא קיומם של שני איזוזימים של,ALS בעלי רגישות שונה לק"ע ופרופיל ביטוי שונה ברקמות )1985 )Rubin and Casida ואולי אף בשלבי התפתחות שונים. השוואת פעילות האנזים )in vitro( ALS מהרקמות השונות בנוכחות המעכב פורמסולפורון עשויה לאשש סברה זו. 24

37 2.3 בחינת עמידות באתר המטרה ALS תגובת האנזים in vitro ALS לפורמסולפורון: עיכוב האנזים,ALS ממיצוי צמחי גס, ע"י ק"ע פורמסולפורון נבחן בראקציה קולורימטרית ספציפית. בארבעת קווי הבוחן לא נמצא הבדל מובהק בתגובת האנזים בין הקוים, הן במיצוי מהנצר והן במיצוי מהשורש )איור 6(. ערכי I 50 המחושבים עבור מיצוי מהנצר )טבלה 6( נמצאים בטווח המקובל לצמחים ללא עמידות באתר המטרה.)Wright and Penner 1998; Rubin and Casida 1985( ALS ההבדלים הקלים ב- I 50 נובעים ככל הנראה משונות אקראית- מכאן שרגישות האנזים אינה המקור להבדלים בתגובת הקווים השונים לאקיפ שנצפו ברמת הצמח השלם. א טבלה 2. ערכי I 50 שחושבו ממשוואת עקומי עיכוב האנזים ALS ע"י פורמסולפורון I 50 ( )nm 03.2 קו IBER IBER001 PVS ER00X ב איור 2. עיכב האנזים ALS ע"י פורמסולפורון. התגובה נמדדה ממיצוי גס מהנצר )א( ומהשורש בארבעת הקווים העיכוב היחסי של פעילות ALS מהשורש )איור 6 ב') קטן מהעיכוב של האנזים מהנצר )איור 6 א') ונע בין 10% ל- 35% בממוצע. עובדה זו עומדת בקנה אחד עם הממצאים של Rubin ו- Casida )1910) שמצאו הבדלים בעיכוב ALS משורש ומנצר תירס ע"י קוטל העשבים כלורסולפורון. החוקרים הסיקו כי בתירס קיימים שני איזוזימים שונים בתגובתם לק"ע, אשר מתבטאים בצורה שונה ברקמות השורש והנצר. הבדלים אלו בתגובת ALS מהשורש ומהנצר 20

38 א) ב) סותרים במידת מה את הממצאים לגבי תגובת השורשים בשלב הנבט )איור 0(, שם היה עיכוב מוגבר בהתארכות השורש בהשוואה לעיכוב התארכות הנצר בעקבות טיפול באקיפ. כפי הנראה תהליכים נוספים מעורבים בתגובה הייחודית של השורש לק"ע, כגון תנועת ק"ע בצמח, השפעה מוגברת של עיכוב הובלת מוטמעים או פרופיל ביטוי שונה של גנים בשלבים פנולוגים שונים- ודרוש מחקר נוסף להבנת תופעה זו רצף הגן ALS בשני מקטעים מועדים למוטציות המקנות עמידות: שני מקטעים בגן ALS הוגברו באמצעות תחלים ספציפיים. המקטעים שנבחרו כוללים שני אתרים- פרולין 197 וטריפטופן 074- אשר שכיחות מקרי המוטציה בהם היא הגבוהה ביותר )2014.)Heap במקטעים שהוגברו לא נמצאה באף אחד מקווי התירס מוטציה המקנה עמידות )איור 7(. עובדה זו מחזקת את המסקנה כי הבדלים באנזים ALS אינם עומדים בבסיס ההבדלים בתגובת הקווים השונים שנבחנו. ב א בהשוואה למקטעים ידועים של,ALS רצף ח"א בקווים שנבחנו במחקר בשני מקטעים בגן איור 7. ארבדופסיס ותירס. הנקודות מעידות על הימצאות ח"א זהה לעמדה המקבילה בארבידופסיס. בניסוי זה הוגברו שני מקטעים (- המקנות עמידות לק"ע ) וטריפטופן )W( 074 הכוללים שני אתרים מועדים למוטציות- פרולין )P( 197 מעכבי.ALS 2.2 תגובת קווי התירס לקוטלי עשבים מקבוצות שונות על מנת להעריך אם הבדלים בתגובת קווי התירס לק"ע מוגבלים לאקיפ, נבחנה תגובתם של הקווים השונים לק"ע מעכבי ALS נוספים, וכן להרבצידים ממנגנוני פעולה שונים, הניתנים קדם או לאחר הצצה )טבלה 1(. הקו הרגיש לאקיפ 'IBER001' נפגע מטיפול לאחר הצצה במעכבי ALS מקבוצת ס"א, שייעודם הדברת ע"ר בתירס: תערובת של ק"ע פורמסולפורון, יודוסולפורון, תיאנקרבזון-מתיל והסייפנר ציפרוסולפמיד )מייסטר-פאוור( ורימסולפורון )טיטוס(. כל הפרטים הפגינו סימני פגיעה ניכרים שבוע מטיפול ובסיום הניסוי אף אחד מהפרטים לא שרד, גם כאשר המינון שניתן היה נמוך פי 4 מהמומלץ. לעומת זאת, בקווים העמידים לאקיפ 'IBER002' ו-' ER00X ' נראו סימני פגיעה קלים בלבד- כגון כלורוזה כללית של עלים צעירים- במינון המומלץ של ק"ע מייסטר-פאוור וטיטוס, וסימני 26

39 Shoot fresh weight (% of control) Shoot fresh weight (% of control) Shoot fresh weight (% of control) Shoot fresh weight (% of control) PVS ו )אטרנקס( g ai ha -1 IBER ה )בזאגרן( ז )אלבר סופר( IBER001 EROOX א )מייסטר פאוור( ב )טיטוס( ד )לאודיס( ג )הוסאר( g ai ha -1 איור 8. תגובת קווי תירס לקוטלי עשבים המיושמים לאחר הצצה. נוף הצמחים נקצר ונשקל 14 ימים מטיפול. קווי השגיאה מייצגים את שגיאת התקן )5=n(. 27

40 ב 8 ז- ב 8 פגיעה קלים עד בינוניים- כגון נקרוזה בקצות עלים ופרקים קצרים- במינון פי 2 מהמומלץ. ירידה מתונה במשקל הטרי של הצמחים- פחיתה של עד כ- 25% לעומת הביקורת- נמדדה עם העלייה במינון מייסטר וטיטוס )איור 8 א ו- היו ירוקים וחיוניים. (. על אף הפגיעות שתוארו, בתום תקופת הניסוי כל הצמחים צמחי המכלוא 'PVS' שטופלו במינון המומלץ של מייסטר פאוור התפצלו בתגובתם, חלק מהפרטים לא שרדו ואחרים התחמקו כליל מפגיעה )מידע אינו מוצג(, ולאחר טיפול בטיטוס לא הייתה פגיעה ניכרת ב- 'PVS' (.)' בעקבות טיפול לאחר הצצה בק"ע מעכב ALS יודוסולפורון בתוספת הסייפנר מפנפיר )הוסאר(- שאינו מורשה לשימוש בתירס- הופיעו סימני פגיעה בינוניים-קשים בשני המכלואים ובקו ההורה,'IBER002' שכללו כתמים נרקוטיים במינונים נמוכים ועלים צעירים נרקוטיים לחלוטין במינונים הגבוהים. לעומת זאת בקו ההורה הרגיש לאקיפ 'IBER001' הופיעו סימני פגיעה קשים בכל המינונים של הוסאר ובסיום תקופת הניסוי אף אחד מהצמחים לא שרד. אף שהייתה השפעה ניכרת לעליה במינון ק"ע בכל הקווים, מבחינת המשקל הטרי בהשוואה לביקורת, ההורה הרגיש נבדל משאר הקווים והגיב לטיפול בהוסאר ברגישות יתר שהתבטאה בהבדלים מובהקים במשקל הטרי לעומת הביקורת כבר במינון נמוך פי 4 מהמומלץ 'IBER001' )איור 8 ג'(. הבדלים בין הקווים בתגובה לק"ע נמצאו גם בטיפול לאחר הצצה בק"ע מעכב HPPD טמבוטריון בתוספת הסייפנר איזוקסדיפן )לאודיס(. בשני הקווים הרגישים לאקיפ 'IBER001' ו-' PVS ' הופיעו סימני פגיעה אופייניים- הלבנה של עלים צעירים- שהחמירו עם הזמן והעליה במינון, בעוד בשני הקווים העמידים לאקיפ לא נראו סימני פגיעה כלל בכל המינונים במשך כל תקופת הניסוי. בסיום הניסוי, צמחי 'IBER001' שטופלו במינונים גבוהים של לאודיס לא שרדו, והיה הבדל ניכר במשקל הטרי לעומת הביקורת גם בטיפול במינונים נמוכים )איור 8 ד'(. בקו,'PVS' על אף סימני פגיעה בינוניים עד קשים בכל המינונים, משקל נמוך מהביקורת נמדד רק בתגובה לטיפול במינון המומלץ של לאודיס, ובשני הקווים הנוספים לא הייתה לטיפול השפעה שלילית על המשקל במינונים שנבחנו. בטיפול לאחר הצצה בשלושה ק"ע נוספים- מעכבי PSII אטרזין )אטרנקס( ובנטזון )באזגרן(, וק"ע הורמונלי D-2,4 )אלבר סופר(- לא נמצא הבדל בתגובת ארבעת הקווים. בטיפול באלבר סופר הופיעו מעט עיוותים אופייניים בכל הקווים, בעיקר במינון כפול מהמומלץ, ובשני הטיפולים האחרים אף אחד מהקווים לא הפגין סימני פגיעה אופייניים לפעילות ק"ע. מלבד אלבר סופר במינון כפול, לשלושת התכשירים הללו לא הייתה השפעה שלילית ניכרת על המשקל הטרי של צמחי התירס בכל המינונים שנבחנו )איור 8 ה'.)' תוצאות טיפולי אחר הצצה מלמדות שהבדלים בין הקווים בתגובתם לק"ע אינם מוגבלים לאקיפ. קו ההורה הרגיש לאקיפ 'IBER001' הפגין רגישות מוגברת, בהשוואה לקווים העמידים לאקיפ 'IBER002' ו-' ER00X ', גם לטיפול לאחר הצצה בק"ע מעכבי ALS נוספים כגון מייסטר פאוור, טיטוס והוסאר, וכן למעכב HPPD לאודיס, זאת על אף שילוב הסייפנרים מפנפיר וציפרוסולפמיד- 21

41 Shoot fresh weight (% of control) Shoot fresh weight (% of control) בפורמולציות ק"ע הוסאר ומייסטר פאוור- ואיזוקסדיפן בלאודיס, שאמורים להגן על התירס מפגיעה. המכלוא הרגיש 'PVS' הפגין רגישות מוגברת למייסטר פאוור וללאודיס, אך לא לטיטוס והוסאר. בטיפולי קדם הצצה באטרזין )אטרנקס, איור 9 ג'( ואיזוקספלוטול )באלאנס, איור 9 ב'( לא היו הבדלים ניכרים בתגובה בין הקווים השונים וכל הקווים הפגינו פגיעות קלות עד בינוניות. לעומת זאת. נמצאה רגישות של קווי ההורים לטיפולי קדם הצצה של דיפלופניקן )קוורץ, איור 9 א'( ומטולאכלור )דואל S גולד, איור 9 ד'( א )קוורץ( IBER001 IBER ג )אטרנקס( g ai ha g ai ha -1 ב )באלאנס( ד )דואל S גולד( ER00X PVS איור 9. תגובת קווי התירס לקוטלי עשבים המיושמים קדם הצצה. נוף הצמחים נקצר ונשקל 14 ימים מטיפול. קווי השגיאה מייצגים את שגיאת התקן )5=n(. הבדלים בתגובה לטיפולי קדם הצצה אינם נמצאים בהתאמה להבדלים בתגובה לאקיפ, ועשויים לנבוע מתכונות המשפיעות על קליטת ק"ע מהקרקע, שאינן קשורות לתגובה לאקיפ שנקלט ברובו דרך העלווה, כפי שנמצא בדיפלופניקן )1992.)Haynes and Kirkwood קווי ההורים של התירס הינם בעלי און צימוח נמוך ביחס למכלואים, עובדה שמתבטאת באון נביטה וקצב התארכות שורש נמוכים שמעודדים קליטה מוגברת של ק"ע המצויים בשכבת הקרקע העליונה, תכונות שעשויות להביא לנזקים מוגברים בשימוש בק"ע שמנגנון הבררנות הינו התחמקות בעקבות סלקטיביות שכבתית. 29

42 כלל העובדות מצביעות על כך שהמנגנון המבקר את התגובה לק"ע אינו מוגבל לאקיפ בלבד, וקשור בתגובה למעכבי ALS נוספים וכן למעכב,HPPD טמבוטריון. רגישות צולבת כנ"ל בקו ההורה 'IBER001' ובמכלוא,'PVS' לעומת עמידות צולבת ב-' IBER002 ' ו-' ER00X ', מעידה כי התגובה לאקיפ מבוקרת ע"י מנגנון כללי שאינו קשור באתר המטרה, ומחזקת את ההשערה כי פנוטיפ התגובה בגנוטיפים אלו קשור במטבוליזם של ק"ע בצמח. בגנוטיפים הרגישים מנגנון נטרול ק"ע ככל הנראה פגום, מה שעשוי להסביר את העובדה ששילוב סייפנרים שונים בפורמולציות ק"ע לא משנה את פנוטיפ התגובה של הקווים הרגישים. על אף הדמיון בפנוטיפ התגובה של המכלוא 'PVS' וקו ההורה,'IBER001' תגובת המכלוא 'PVS' נבדלת מקו ההורה הרגיש בכך שמכלוא זה לא מפגין רגישות מוגברת למעכבי ALS הוסאר וטיטוס. ישנה אפשרות כי ישנם מספר גנים המבקרים את תהליכי נטרול ק"ע בצמח, ולקווים הנ"ל גנוטיפ זהה בגן המבקר נטרול של הרבצידים מסויימים וגנוטיפ שונה בגן המבקר נטרול טיטוס והוסאר. תופעה דומה הודגמה בעבר ע"י Barrett וחובריו )1997( אשר הראו כי בתירס קיימים שני גנים באפיסטזיס דומיננטי אשר משפיעים על הנטרול של ק"ע שונים. 2.5 השפעת סייפנרים על תגובת קווי התירס לפורמסולפורון על מנת לבודד את השפעת הסייפנר איזוקסדיפן-אתיל על תגובת קווי התירס לק"ע אקיפ, נבחנה תגובת הקווים ליישום מפוצל ומשולב של הסייפנר וק"ע פורמסולפורון- החומרים הפעילים בפורמולציה המסחרית אקיפ. החומרים ניתנו במינון המומלץ ובמינון כפול, ביחס.)wt/wt( 1:1 עפ"י ניתוח שונות דו גורמי שנערך ישנה השפעה מובהקת לקו, לטיפול שניתן וכן השפעת גומלין קו x טיפול.)p(F)<0.001( טיפול באיזוקסדיפן בלבד, במינון המומלץ או במינון כפול, לא פגע באף אחד מהקווים, לא נראו סימני פגיעה ייחודיים ולא הייתה השפעה שלילית מבחינת המשקל הטרי של הנוף, ואף הייתה השפעה חיובית במינון כפול. טיפולים בפורמסולפורון בלבד ושילוב של פורמסולפורון והסייפנר, במינון המומלץ או במינון כפול, גרמו לתוצאה דומה לטיפול באקיפ. נצפתה פגיעה מובהקת בקווים הרגישים 'IBER001' ו-' PVS ' בהשוואה לביקורת- להוציא צמחים מתחמקים של 'PVS' שלא נפגעו- והצמחים הפגועים לא שרדו את הטיפול. מאידך לא נראתה פגיעה בקווים 'IBER002' ו-' ER00X ', הן מבחינת סימני פגיעה והן מבחינת משקל טרי בסיום הניסוי )איור 15(. הסייפנר איזוקסדיפן נמצא כמקנה הגנה לתירס מפני פגיעת פורמסולפורון, ומנגנון הפעולה המשוער הוא הגברת ביטוי ופעילות של אנזימים המעורבים בפירוק ק"ע );2010 Williams and Pataky.)Bunting et al.,2004a 2004b במקרה של קווי תירס סופר מתוק שנחקרו במחקר זה, נראה כי איזוקסדיפן-אתיל הינו חסר חשיבות בתגובה לק"ע- אינו פיטוטוקסי בעצמו אך אינו תורם להגנה על הקווים הרגישים, וגם בלעדיו אין פגיעה בקווים העמידים. ככל הנראה מנגנון פירוק פורמסולפורון בקווים העמידים יעיל במידה כזו שאין צורך בהגברתו ע"י הסייפנר, בטווח המינונים המומלץ. 35

43 Shoot fresh weight (% of control) IBER001 IBER002 ER00X PVS * * * * * * * * * * * * * * איור 01. תגובת קווי התירס ליישום מפוצל של פורמסולפורון והסייפנר איזוקסדיפן-אתיל. נוף הצמחים נקצר ונשקל 14 יום מטיפול )המינון המומלץ X= 40 ג' להקטר פורמסולפורון או איזוקסדיפן(. Treatment * ממוצע שונה במובהק מביקורת לא מטופלת עפ"י מבחן )0.05=α(. Dunnett קווי השגיאה מייצגים את שגיאת התקן )6=n(. לעומת זאת בקווים הרגישים מנגנון ההגנה עשוי להיות פגום לחלוטין, לכן הוספת סייפנר לא יכולה לספק הגנה. לחילופין ישנה אפשרות כי בקווים הרגישים קיים מנגנון הגנה אינדוקטיבי, שעשוי לספק הגנה מפני פורמסולפורון במידה ויופעל ע"י הסייפנר, אך פגם באינטראקציה עם איזוקסדיפן מונע את פעולתו. לדוגמה, נמצאו בתירס מספר איזוזימים ל- GST חלקם קונסטיטוטיבים וחלקם אינדוקטיבים, אשר בעקבות טיפול בסייפנרים שונים עולה ביטויים )2004.)Hatzios and Burgos פגם בבקרת הביטוי ע"י הסייפנר ימנע או יקטין את יכולתו לספק הגנה מק"ע במידה ונטרולם תלוי באיזוזימים האינדוקטיבים. בנוקסקור ודיכלורמיד הינם סייפנרים המקנים הגנה לתירס מפגיעת ק"ע שונים )1989 )Hatzios ומשולבים בפורמולציות מסחריות שונות. האפשרות של הגנה מפני פגיעת פורמסולפורון ע"י סייפנרים אלו נבחנה ע"י יישומם בשילוב עם ק"ע פורמסולפורון הניתן במינון 40 ג' להקטר, ביחס [wt/wt] 1:1 והשוואה לטיפול פורמסולפורון + איזוקסדיפן וטיפול באקיפ )איור 11(. עפ"י ניתוח שונות דו גורמי שנערך ישנה השפעה מובהקת לקו, לטיפול שניתן וכן השפעת גומלין קו x טיפול.)p(F)<0.001( שילוב הסייפנרים דיכלורמיד ובנוקסקור לא הגן על הקווים הרגישים 'IBER001' ו-' PVS ': סימני פגיעת פורמסולפורון נראו היטב, מרבית הצמחים לא שרדו את הטיפול וישנו הבדל מובהק במשקל הטרי בהשוואה לביקורת לא מטופלת. במקרה של הקווים העמידים 31

44 Shoot fresh weight (% of control) 'IBER002' ו-' ER00X ', שילוב הסייפנרים לא הגן מפגיעת פורמסולפורון ואף היה בעל השפעה פיטוטוקסית על הצמחים שהתבטאה בפרקים קצרים, פגיעה בשליפת עלים ועלים מעוותים. השימוש בבנוקסקור גרם לפחיתה מובהקת במשקל שני הקווים העמידים לאקיפ, בעוד שימוש בדיכלורמיד גרם לפחיתה במשקל המכלוא העמיד בלבד. חוסר היכולת של סייפנרים ידועים לספק הגנה מפני פורמסולפורון לקווים הרגישים לאקיפ מחזק את המסקנה כי מנגנון ההגנה שלהם פגום באופן מוחלט, אם עקב פגם בפעילות האנזימ/ים ואם פגם בביטוי ובבקרה אשר מונעים מהסייפנרים לבצע את יעודם. 120 IBER001 IBER002 ER00X PVS * * * Treatment איור 00. השפעת הסייפנרים דיכלורמיד ובנוקסקור על תגובת קווי התירס לפורמסולפורון. נוף הצמחים נקצר ונשקל 14 יום מטיפול. אקיפ ניתן במינון 40 גח"פ להקטר; פורמסולפורון או הסייפנרים ניתנו במינון ג' 40 * * * * * * * להקטר. * * ממוצע שונה במובהק מביקורת לא מטופלת מבחן )0.05=α(. Dunnett קווי השגיאה מייצגים את שגיאת התקן )5=n( foramsulfuron + isoxadifen equip foramsulfuron + benoxacor foramsulfuron + dichlormid עפ"י 2.2 השפעת מעכב פעילות CYT P450 על תגובת קווי התירס לקוטלי עשבים מלתיון הינו קוטל חרקים, אורגנו-פוספט, אשר ידוע כמעכב פעילות P450 בצמחים, עובדה המשמשת להוכחת מעורבותו בנטרול ק"ע בצמח (2006.(Matzrafi et al. ;2014 Siminszky על מנת לבחון מעורבות אנזימים ממשפחת CYT P450 בתגובת קווי התירס לפורמסולפורון, רוססו הצמחים בשילובים שונים של ק"ע, סייפנר ומלתיון. עפ"י ניתוח שונות דו גורמי שנערך ישנה השפעה מובהקת לקו, לטיפול שניתן וכן השפעת גומלין קו x טיפול.)p(F)<0.001( לטיפול באיזוקסדיפן ומלתיון, משולב או נפרד, לא הייתה השפעה מובהקת על קווי התירס- באף אחד מהקווים לא נראו סימני פגיעה מהותיים ולא היה הבדל מובהק במשקל הטרי לעומת הביקורת בתום תקופת הניסוי )איור 12(. 32

45 Shoot fresh weight (% of control) טיפול בפורמסולפורון בלבד, שילוב פורמסולפורון עם איזוקסדיפן וטיפול באקיפ גרמו לפגיעות קשות בקווים הרגישים 'IBER001' ו-' PVS ', שהתבטאו בהבדלים מובהקים במשקל לעומת הביקורת. יוצא דופן היה המכלוא 'PVS' לאחר טיפול בפורמסולפורון- 3 מתוך חמישה פרטים התחמקו מפגיעה לכן אין הבדל מובהק במשקל בהשוואה לביקורת. בדומה לניסוי קודם )איור 15( הקווים העמידים לא נפגעו מטיפולי פורמסולפורון, עם וללא הסייפנר. טיפול מוקדם במלתיון הגביר את הפגיעה של פורמסולפורון בצמחים העמידים 'IBER002' ו- 'ER00X' באופן מובהק. מאידך בטיפולים בהם שולב גם הסייפנר, בפורמולציה המסחרית אקיפ או בפורמולציה שהוכנה במעבדה, הגברת הפגיעה בקווים העמידים בעקבות תוספת מלתיון לא הייתה מובהקת. 120 IBER001 IBER002 ER00X PVS * * * * * * * * * * * * * איור 04. השפעת מלתיון על תגובת קווי התירס לפורמסולפורון ואיזוקסדיפן-אתיל. נוף הצמחים נקצר ונשקל 14 יום מטיפול. מלתיון ניתן במינון 1555 ג' להקטר; אקיפ ניתן במינון 40 גח"פ להקטר; פורמסולפורון או איזוקסדיפן ניתנו במינון 40 ג' להקטר. * Treatment ממוצע שונה במובהק מביקורת לא מטופלת עפ"י מבחן )0.05=α(. Dunnett קווי השגיאה מייצגים את שגיאת התקן )5=n(. השפעת מלתיון על התגובה לק"ע מעכבי ALS טיטוס והוסאר בקווים העמידים לאקיפ, וכן השפעתו על התגובה לאקיפ במינון כפול מהמומלץ )95 גח"פ להקטר( נבחנה גם כן )איור 13(. המינונים שנבחרו הינם מינונים אשר אינם פוגעים בצורה מובהקת בקווים העמידים לאקיפ )איור 1 ואיור 3(. עפ"י ניתוח שונות דו גורמי שנערך אין השפעה מובהקת לקו,)p(F)=0.083( יש השפעה מובהקת לטיפול שניתן לקווים )p(f)<0.001( ואין השפעת גומלין קו x טיפול. בעוד טיפול במלתיון או בכל אחד מק"ע בנפרד לא גרם לפגיעה מובהקת בצמחים, טיפול במלתיון בשילוב טיפול בק"ע גרם לעיכוב ניכר בהתפתחות, הופעת סימני פגיעה, כגון פרקים קצרים ועיוותים בעלים, והבדל מובהק 33

46 Shoot fresh weight (% of control) במשקל הטרי לעומת הביקורת )איור 13(. מבחינת המגמה הכללית, הפגיעה במכלוא -'ER00X' בטיפולים בהם שולבו מלתיון וק"ע- הייתה גדולה יותר, אך הבדלים אלו אינם מובהקים ברמת המובהקות 0.05=α. הגברת הפיטוטוקסיות של ק"ע בקווים העמידים לאקיפ, בעקבות טיפול מוקדם במעכב פעילות -CYT P450 המלתיון, מעידה על מעורבותם של אנזימים ממשפחת P450 במטבוליזם של ק"ע מעכבי ALS מקבוצת ס"א בקווים אלו, והיותם מרכיב מרכזי בבררנות ק"ע. טיפול במלתיון לא גרם לרגישות זהה לזו שנצפתה בקווים הרגישים לאקיפ, ומרבית הצמחים שרדו את הטיפול המשולב על אף הפגיעות הקשות. אפשר ומלתיון אינו מעכב יעיל דיו של ה- P450 הספציפי שמעורב בנטרול ק"ע שנבחנו, או שהמינון שנבחר ליישום גורם לעיכוב חלקי בלבד. מאידך, לא ניתן לשלול את האפשרות שהעמידות מורכבת ממספר תהליכים מקבילים בצמח, בעלי אפקט תוספתי או סינרגיסטי, ולכן עיכוב של רכיב אחד )P450( לא מוביל לרגישות מוחלטת. כך או כך, תוצאות אלו מוכיחות כי לפעילות P450 חלק מרכזי בעמידות קווי תירס סופר מתוק במחקר זה לפורמסולפורון, 120 IBER002 ER00X * * * * * * איור 13. השפעת מלתיון על התגובה למעכבי ALS בקווי תירס עמידים לאקיפ. נוף הצמחים נקצר ונשקל 14 יום מטיפול. מלתיון ניתן במינון 1555 ג' להקטר; אקיפ ניתן במינון 95 גח"פ להקטר; הוסאר ניתן במינון 20 גח"פ להקטר; טיטוס ניתן במינון 12.0 גח"פ להקטר. Treatment * ממוצע שונה במובהק מביקורת לא מטופלת עפ"י מבחן )0.05=α(. Dunnett קווי השגיאה מייצגים את שגיאת התקן )5=n(. שילובו של הסייפנר איזוקסדיפן-אתיל בפורמולצית ק"ע הקטין את ההשפעה השלילית של מלתיון והגן על הקווים העמידים לפורמסולפורון מפגיעה )איור 12(. פעילותו של איזוקסדיפן-אתיל אנטגוניסטית למלתיון, עובדה המחזקת את הסברה הרווחת כי איזוקסדיפן מקנה הגנה לתירס ע"י 34

47 Shoot fresh weight (% of control) הגברת פעילות P450. עם זאת יכולת ההגנה של הסייפנר מוגבלת, כאשר מלתיון ניתן בשילוב מינון גבוה של אקיפ )איור 13(. ולא הקנתה הגנה מפגיעה 2.2 תורשת רגישות לאקיפ על מנת לבחון את תורשת הפנוטיפ הרגיש לפורמסולפורון, נבחנה תגובת צאצאי הכלאות שונות לק"ע אקיפ. צאצאי הכלאות רציפרוקליות, של קו ההורה הרגיש 'IBER001' וקו ההורה העמיד,'IBER002' שרוססו במינון המומלץ של אקיפ לא נפגעו- לא הופיעו סימני פגיעה אופייניים ולא היה הבדל מובהק במשקל הטרי בהשוואה לביקורת בתום תקופת הניסוי )איור 14). פנוטיפ המכלוא אינו תלוי בכיוון ההכלאה, כלומר מקור התכונה אינו בגן מיטוכונדריאלי או פלסטידי אלא בגן גרעיני ולכן תורשת הרגישות אינה אימהית. 120 Control 'Equip' 45 g ai ha # # IBER002 X IBER001 IBER001 X IBER002 Cross איור 02. תגובת צאצאי הכלאות רציפרוקליות של קווי ההורים לאקיפ. קווי השגיאה מייצגים את שגיאת התקן.)n=12;#n=9( התפצלות פנוטיפ התגובה לטיפול באקיפ נבחנה באוכלוסיות F2, צאצאי הפריות עצמיות של המכלואים. אוכלוסיית F2 של המכלוא הרגיש 'PVS' אינה מתפצלת בתגובתה לאקיפ- כל הפרטים מפגינים סימני פגיעה אופייניים לפעילות ק"ע ובנוסף ישנה פגיעה בהתפתחות המתבטאת בהבדלים במשקל הטרי, המתפלג סביב ממוצע נמוך ב- 72% מממוצע הביקורת )איור 10 א' ו-ב'(. ממוצע המשקל של הצמחים המטופלים )21% מביקורת( נבדל באופן מובהק מממוצע משקל צמחי הביקורת עפ"י מבחן (0.05=α). Tukey אוכלוסיית F2 של המכלוא העמיד,'ER00X' הינה אוכלוסייה מתפצלת מבחינת התגובה לאקיפ- בחלק מהפרטים נראים סימני פגיעה קשים ובאחרים אין סימנים כלל. בעוד המשקל הטרי בביקורת מתפלג בצורה נורמלית סביב הממוצע )איור 10 ג'(, התפלגות המשקל הטרי של מדגם הצמחים המטופלים הינה בי-מודלית, בעלת שני שיאים )איור 10 ד'(. כל הפרטים שמשקלם נמוך ב- 05% 30

48 Probability (%) Probability (%) ויותר מממוצע משקל הביקורת סווגו כרגישים, וממוצע משקלם 17%( מביקורת( נבדל במובהק- עפ"י מבחן )0.05=α(- Tukey הן מממוצע הביקורת והן מממוצע הפרטים שסווגו כעמידים )152% מביקורת(. לעומת זאת אין הבדל מובהק בין ממוצע משקל הפרטים המטופלים בעלי פנוטיפ עמיד לממוצע הביקורת. חלקם היחסי של הפרטים שסווגו כרגישים, במדגמי אוכלוסיית F2 של,'ER00X' 2 הינו 23%- יחס עמידים:רגישים אינו נבדל במובהק מ- 1:3, עפ"י מבחן (0.05=α), χ היחס הצפוי במקרה של תורשת גן יחיד עם אלל דומיננטי לעמידות ואלל רצסיבי לרגישות א ( PVS )F2 Control 'Equip' 45 g ai ha ג ( ER00X )F )F2 ER00X ( ב ( PVS )F2 ד Shoot fresh weight (% of control) Shoot fresh weight (% of control) איור 05. התפלגות צאצאים מדור F2 של מכלואי תירס בתגובה לאקיפ. התוצאות הן ממוצע של 3 מדגמים בלתי תלויים של אוכלוסיית F2 של 'ER00X' ו- 2 מדגמים של אוכלוסיית F2 של.'PVS' קווי השגיאה מייצגים את שגיאת התקן. צאצאי הכלאות מחזירות של המכלוא 'ER00X' עם ההורה הרגיש 'IBER001' מתפצלים בתגובתם לאקיפ לעומת )איור 16 א'(: 47% 03% מהפרטים הפגינו סימני פגיעה אופייניים לפעילות ק"ע וסווגו כרגישים, שלא הפגינו סימני פגיעה כלל וסווגו כעמידים. הבדלים מובהקים נמצאו בממוצע המשקל של שתי הקבוצות ונמצא כי יחס עמידים:רגישים אינו שונה במובהק מ- 1:1, עפ"י מבחן 2 χ (0.05=α). מאידך, צאצאי הכלאה מחזירה עם ההורה העמיד 'IBER002' לא נפגעו )איור 16 ב'(, לא הופיעו סימני פגיעה מהותיים וכל הפרטים סווגו כעמידים. 36

49 א) ב) תגובת צאצאי הכלאות מחזירות של המכלוא 'ER00X' לטיפול באקיפ מחזקת את המסקנה כי הרגישות מבוקרת ע"י אלל רצסיבי )s( בגן יחיד, כאשר האלל הדומיננטי )R( מקנה עמידות לק"ע. בתכונה המבוקרת ע"י גן יחיד, היחס הפנוטיפי הצפוי של צאצאי הכלאה בין הומוזיגוט רצסיבי להטרוזיגוט הוא 1:1. לעומת זאת, בהכלאה בין הטרוזיגוט להומוזיגוט דומיננטי פנוטיפ הצאצאים, בתכונה הרלוונטית, צפוי להיות אחיד וזהה לפנוטיפ ההומוזיגוט הדומיננטי. במקרה זה 'IBER001' הינו כפי הנראה הומוזיגוט לאלל הרצסיבי הגורם לרגישות )s 'IBER002' s(, הומוזיגוט לאלל הדומיננטי המקנה עמידות )R R( ו-' ER00X ' הטרוזיגוט )s R(. א ב ER00X X IBER001 IBER002 IBER002 ER00X ER00X X IBER001 IBER002 ER00X IBER001 איור 02. תגובת צאצאי הכלאות מחזירות של המכלוא 'ER00X' לאקיפ. בתמונות מוצגים פרטים מייצגים של צאצאי הכלאות מחזירות עם קו ההורה הרגיש 'IBER001' ההורה העמיד 'IBER002' (, לצד קווי ההורים והמכלוא 14 יום מטיפול ב- 40 גח"פ להקטר. וקו ) המכלוא 'PVS' מפגין רגישות יתר לאקיפ, ומלבד מספר פרטים מתחמקים אינו שורד טיפול במינון המומלץ )איור 4(. מכלוא זה הינו מרקע גנטי שונה משאר הקווים במחקר, ולכן ישנה אפשרות כי המנגנון המבקר את התגובה לאקיפ שונה, והגנוטיפ בגן לרגישות )שתואר בסעיף זה( שונה. על מנת לבחון את גנוטיפ המכלוא הרגיש 'PVS' נערכו הכלאות מבחן עם קו ההורה הרגיש 'IBER001' וקו ההורה העמיד,'IBER002' ונבחנה תגובתם של צאצאי ההכלאות לק"ע אקיפ, בהשוואה לתגובת צמחי המכלוא וכל אחד מקווי ההורים )איור 17(. עפ"י ניתוח שונות דו גורמי שנערך ישנה השפעה מובהקת לקו/הכלאה, לטיפול שניתן וכן השפעת גומלין קו/הכלאה x טיפול.)p(F)<0.001( צאצאי הכלאה עם ההורה הרגיש לא נבדלים מהוריהם בתגובה לאקיפ- על הצמחים הופיעו סימני פגיעה אופייניים והייתה פחיתה מובהקת במשקל הטרי לעומת הביקורת. לעומת זאת, צאצאי הכלאה של 'PVS' עם ההורה העמיד 'IBER002' שטופלו באקיפ, היו כולם עמידים. פנוטיפ הצאצאים, מבחינת התגובה לאקיפ, היה דומה להורה העמיד- צמחים חיוניים, ללא סימני פגיעת ק"ע וללא פחיתה מובהקת במשקל לעומת מהביקורת. מאידך, במכלוא 'PVS' נראו סימני פגיעה ברורים בעקבות הטיפול, והמשקל היה נמוך בהשוואה לביקורת )איור 17(. 37

50 Shoot fresh weight (% of control) * איור 02. תגובת צאצאי הכלאות מבחן של המכלוא 'PVS' לאקיפ. ממוצע שונה במובהק מביקורת לא מטופלת, עפ"י מבחן )0.05=α(. Dunnett קווי השגיאה מייצגים את שגיאת התקן n=5 n=5 n=5 * n=5 Control 'Equip' 45 g ai ha -1 * n=4 n=5 n=6 n=40 n=10 * n=11 PVS IBER001 IBER002 PVS X IBER002 PVS X IBER001 genotype/ cross צאצאי הכלאה עם הקו העמיד,'IBER002' הומוזיגוט דומיננטי לאלל R המקנה עמידות, עמידים לאקיפ בעוד צאצאי הכלאה עם הקו הרגיש,'IBER001' הומוזיגוט רצסיבי לאלל s, רגישים לאקיפ. מכאן שהתגובה לאקיפ במכלוא 'PVS' מבוקרת ע"י אותו גן שאחראי על התגובה בקווי,'IBER' ו- 'PVS' הינו הומוזיגוט לאלל הרצסיבי s בגן זה ולכן נפגע מק"ע. במידה ומנגנון התגובה לאקיפ בקו 'PVS' היה שונה- כלומר מבוקר ע"י גן או גנים שונים מאלו המבקרים את התגובה לק"ע בקווי -'IBER' הרי שכל הצאצאים משתי ההכלאות הנ"ל צפויים להיות רגישים. 2.8 סמנים גנטים לרגישות לאקיפ את שבעה סמנים גנטים קו-דומיננטים מסוג (SSR( Small Sequence Repeat )טבלה 3(, המאגפים הלוקוס nfs1/ben1 בתירס, ונמצאו בעבר כפולימורפים לק"ע שונה תגובה בעלי קווים בין שונים, בינהם פורמסולפורון 2012(,)Nordby et al. 2008; Tseng הוגברו בראקצית PCR בקווי ההורים 'IBER001' ו-' IBER002 '. נמצאו פולימורפים בין קווי ההורים השונים. רק שניים משבעה סמנים שנבחנו- לאקיפ נבחנה בצאצאים מדור F2 של המכלוא 'ER00X' )איור 11(. bnlg % הומוזיגוטים הן העמידים מהפרטים במדגם היו בעלי פנוטיפ רגיש לאקיפ, לסמן הומוזיגוטים שונה במובהק מ- 1:2:1 - הרגיש, עפ"י מבחן bnlg1382 ל- bnlg1382 והן לסמן מההורה ו- dupssr1 - התאמה בין מופע הסמנים הנ"ל לפנוטיפ התגובה dupssr1 הרגיש. הומוזיגוט לסמן מההורה העמיד מההורה כאשר כל הרגיש, הפרטים בעוד רק 3.3% הרגישים התפצלות כל אחד מהסמנים בדור הינם מהפרטים F2 : הטרוזיגוט : אינה הומוזיגוט לסמן מההורה 2 (0.05=α). χ כמו כן, נראה כי שני הסמנים נמצאים בתאחיזה הדוקה זה לזה, כיוון שלא היו פרטים רקומביננטים, עם מופע אללי שונה בכל סמן. מופע הסמנים bnlg1382 ו- dupssr1, נבחן גם במכלוא 'PVS' ובדור F2 שלו. ראקציית PCR עם תחלים ספציפיים לסמן bnlg1382 לא הניבה תוצרים הן במכלוא והן בדור F2, לעומת זאת הסמן 31

51 ER00X IBER002 IBER001 dupssr1 כן נתן תוצר. במדגם זה של המכלוא הרגיש 'PVS' 25% מהפרטים התחמקו מפגיעה. כל הפרטים שהיו בעלי פנוטיפ רגיש לאקיפ הינם הומוזיגוטים לסמן dupssr1 בעל מופע וגודל דומה לסמן של הקו הרגיש,'IBER001' לעומת זאת פרטים בעלי פנוטיפ עמיד במדגם הינם הטרוזיגוטים: הסמן בעל שני בנדים, אחד בגודל דומה לסמן בקו 'IBER001' והשני לסמן בקו העמיד 'IBER002' )איור 19(. צאצאים מדור F2 של המכלוא היו כולם רגישים לטיפול באקיפ וכל הפרטים הומוזיגוטים לסמן dupssr1 בעל מופע וגודל דומה לקו 'IBER001' הרגיש לאקיפ. א ב ביקורת לא מרוססת 200bp bp 200bp 100bp ג איור 08. התאמה בין סמנים גנטים לפנוטיפ התגובה לאקיפ בדור F2 של.'ER00X' DNA הופק מצאצאים מדור F2 של המכלוא 'ER00X' שטופלו באקיפ, הוגבר בראקצית PCR עם תחלים ספציפיים והורץ בג'ל אגרוז. א( פנוטיפ התגובה 14 יום מריסוס בפרטים מייצגים ב( מופע הסמן.bnlg1382 ג( מופע הסמן.dupssr1 תוצאות ניסוי זה מחזקות את המסקנה כי התגובה לאקיפ, במכלוא,'PVS' מבוקרת ע"י אותו גן המבקר את התגובה בקווי.'IBER' המכלוא 'PVS' אינו אחיד מבחינת התגובה לאקיפ, דבר המתבטא גם במופע הסמן הגנטי- 'PVS' הינו ככל הנראה הומוזיגוט רצסיבי לאותו אלל הגורם לרגישות לק"ע בקו ההומוזיגוטי,'IBER001' כאשר המכלוא אינו נקי וכ- 25 אחוז מפרטיו הינם הטרוזיגוטים בגן לרגישות ולכן עמידים לאקיפ. 39

52 IBER002 IBER001 א 200bp 100bp ביקורת לא מרוססת ב איור 09. התאמה בין סמנים גנטים לפנוטיפ התגובה לאקיפ בדור F2 של.'PVS' ב PCR שטופלו באקיפ, הוגבר בראקצית 'PVS' של המכלוא הופק מצאצאים מדור F2 DNA עם תחלים ספציפיים והורץ בג'ל אגרוז. א( פנוטיפ התגובה 14 יום מריסוס בפרטים מייצגים ב( מופע הסמן.dupssr1 45